李 強 郭壯波 伍光穎 李超霞 鐘志勇

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院，廣州市紅十字會醫(yī)院1急診科，廣東 廣州510220;2檢驗科，廣東廣州510220;3廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心，廣東佛山528248)

血管內(nèi)皮細胞具有維持血管彈性，保持血管內(nèi)膜完整，防止血細胞黏附、防血栓形成等重要功能。內(nèi)皮功能障礙、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡均為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的關(guān)鍵因素。內(nèi)皮功能障礙貫穿于AS及斑塊不穩(wěn)定的形成過程中，從而導(dǎo)致包括急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)在內(nèi)的臨床事件［1］發(fā)生。因此評估內(nèi)皮損傷程度、內(nèi)皮功能狀態(tài)對動脈粥樣硬化性疾病和急性心血管事件的發(fā)生具有重要價值。EMP是內(nèi)皮細胞激活或凋亡時產(chǎn)生的膜性小囊泡。EMP新近被認(rèn)為是能夠反映內(nèi)皮損傷及功能障礙的替代性標(biāo)記，但其對于ACS的預(yù)測價值尚不清晰。本研究擬建立大白鼠急性心肌缺血的模型，通過檢測心肌缺血不同時段EMP和cTNT、CK－MB的動態(tài)變化，及統(tǒng)計大鼠心肌缺血后心肌細胞凋亡率，探討EMP作為早期急性心肌缺血評估指標(biāo)的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠24只，SPF級，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供(實驗動物使用許可證號:SYXK粵2013－0002)。根據(jù)體質(zhì)量隨機分為Sham組、MI組、I/R組，每組8只。

1.1.2 試劑與儀器 試劑:CK－MB試劑盒(武漢華美生物科技)，cTnT ELISA Kit(武漢華美生物科技);CD31－PE熒光標(biāo)記單抗(美國 BD公司);CD42b－FITC熒光標(biāo)記單抗(美國BD公司)。儀器:7020型全自動生化分析儀(日本HITACHI公司);流式細胞儀(型號:FACSCATON，美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 研究分組 Sham組大鼠進行開胸與穿線處理，但不結(jié)扎阻斷冠狀動脈左前降支。MI組在Sham組的基礎(chǔ)上，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，結(jié)扎后不再復(fù)通。I/R組在Sham組的基礎(chǔ)上，結(jié)扎冠狀動脈左前降支30min后進行復(fù)通。

1.2.2 心肌缺血模型構(gòu)建 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉，剃去頸部和胸部毛發(fā)，以75%酒精擦拭消毒頸部皮膚后作正中切口約1 cm，暴露氣管，進行氣管插管并連接呼吸機(呼吸機工作條件:呼吸頻率70～80次/MIn，潮氣量7～8 mL，呼吸時間比為1∶1)。待大鼠呼吸與呼吸機同步后，測量大鼠心電圖基礎(chǔ)值。取心電圖無異常大鼠，消毒胸部皮膚后，剪開皮膚并鈍性分離胸部肌肉直至暴露肋骨，剪開第3與第4根肋骨，擴開大鼠胸腔，充分暴露心臟。用眼科鑷撕開大鼠心臟心包膜，尋找大鼠左心耳與動脈圓錐，在左心耳與動脈圓錐之間穿入0號線，結(jié)扎，以心電圖Ⅱ?qū)?lián)檢測，有典型缺血心電圖改變者判定冠狀動脈左前降支成功結(jié)扎，可進行下一步縫合或者復(fù)通操作。所有大鼠模型建立完畢后，逐層縫合大鼠肌肉和皮膚，擠出大鼠胸腔空氣后撤去呼吸機，歸籠單籠飼養(yǎng)。

1.2.3 標(biāo)本的采集與處理 Sham組以穿線為造模結(jié)束時間點，MI組，I/R組以復(fù)通冠狀動脈左前降支為造模結(jié)束時間點，在造模結(jié)束后2和24 h，分別采集大鼠血清與血漿(檸檬酸鈉抗凝)，于－80℃保存?zhèn)溆?。造模結(jié)束后2、24 h，分別解剖取大鼠心臟，以4%中性甲醛固定。

1.2.4 指標(biāo)測定 cTNT:依照ELISA Kit說明書，使用ELISA Kit進行檢測。CK－MB:全自動生化分析儀檢測樣本中CK－MB含量。EMP:流式細胞術(shù)檢測樣本EMP。染色:樣本加抗 CD31－PE(1∶100比例用PBS稀釋)和抗 CD42b－FITC(1∶200比例用 PBS稀釋)各10μL，然后加入50μL血漿樣本，于暗處孵育30 min。孵育結(jié)束后加入1 000μL PBS混勻待測。上機測定:設(shè)定上機吸樣速度為中速，吸樣時間為30 s，上機檢測EMP，記錄 CD31+/CD42b－為 EMP的量。心肌細胞凋亡檢測:以Tunel法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況，每只大鼠造模后2h和24h分別處死，取心臟固定后制備石蠟切片，依照羅氏Tunel細胞凋亡檢測試劑盒進行操作，DAB染色，光學(xué)顯微鏡下每張切片選取具有代表性的3個視野，使用IPP 6.0軟件分別對凋亡細胞(細胞核呈棕色)和正常細胞進行計數(shù)，統(tǒng)計不同大鼠心肌細胞的凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)方法對各量化檢測指標(biāo)進行統(tǒng)計處理并列表說明，各組數(shù)據(jù)以，采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行重復(fù)測量的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CK－MB的水平比較

造模后2 h和24 h，各組組間CK－MB水平比較未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。兩個時間點前后比較，Sham組大鼠的CK－MB水平變化無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);MI組大鼠的CK－MB表達水平顯著性升高(P＜0.05)。見表 1。

表1 各組大鼠血液CK-MB的表達(±s，U/L)

表1 各組大鼠血液CK-MB的表達(±s，U/L)

注:與造模后2 h比較，*P＜0.05

CK－MB組別 n 2 h 24 h Sham 8 368.5±111.4 377.6±193.6 MI 8 208.9±51.3 372.3±126.6*I/R 8 222.2±101.0 327.7±116.5

2.2 ELISA檢測各組大鼠cTNT的水平比較

造模后2 h，各組組間CK－MB水平比較未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。造模后24 h，I/R組cTNT表達水平低于MI組(P＜0.05)。兩個時間點前后比較，Sham組、MI組大鼠的cTNT水平無明顯變化(P＞0.05)。I/R組大鼠的cTNT水平呈現(xiàn)下降的趨勢(P＜0.05);與MI組比較cTNT水平呈現(xiàn)下降的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組SD大鼠cTNT的表達(ˉ±s，pg/mL)

表2 各組SD大鼠cTNT的表達(ˉ±s，pg/mL)

注:與造模后2 h比較，#P＜0.05;與MI組比較，*P＜0.05

cTNT組別 n 2 h 24 h Sham 8 131.0±124.2 129.8±52.7 MI 8 120.7±62.6 149.0±38.8 I/R 8 179.2±15.1 88.4±29.7#*

表3 各組大鼠血清EMP的表達(±s，個/50μL)

表3 各組大鼠血清EMP的表達(±s，個/50μL)

注:與 MI組比較，*P＜0.05;與 Sham 組比較，#P＜0.01

EMP組別 n 2 h 24 h Sham 8 0.50±1.07 0.13±1.35 MI 8 31.25±27.18# 33.63±33.78#I/R 8 0.50±0.76* 10.13±28.24*

圖1 造模后2、24 h Sham組與MI組EMP流式細胞圖

2.3 流式細胞儀檢測各組大鼠EMP水平比較

造模后2 h，MI組大鼠EMP表達水平顯著高于Sham組及I/R組(P＜0.05);造模后24 h，MI組大鼠EMP表達水平顯著高于Sham組(P＜0.05);I/R組大鼠EMP表達水平與Sham組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);MI組大鼠EMP表達水平顯著高于I/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各組間EMP表達水平造模后2 h與造模后24 h EMP表達水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表3及圖1－2。

圖2 造模后2、24 h I/R組與MI組EMP流式細胞圖

2.4 Tunnel檢測各組大鼠心肌細胞凋亡率的影響

造模后2 h MI組、I/R組大鼠的心肌細胞凋亡率分別與Sham組比較，顯著提高(P＜0.05)，I/R組大鼠的心肌細胞凋亡率比MI組稍降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);造模后24 h，MI組、I/R組大鼠的心肌細胞凋亡率分別較Sham組稍高，而I/R組比MI組稍低，但均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);各組間造模后2 h與造模后24 h心肌細胞凋亡率比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表4及圖3－4。

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡率的比較±s，%)

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡率的比較±s，%)

注:與Sham組比較，*P＜0.05

組別 n 凋亡率2 h 24 h Sham 8 8.21±1.10 45.14±20.65 MI 8 41.56±12.51* 49.14±18.30 I/R 8 39.27±10.42* 47.71±13.63

圖3 造模后2 h Sham組和MI組大鼠TUNEL染色結(jié)果(×400)

圖4 造模后2 h Sham組和I/R組大鼠TUNEL染色結(jié)果(×400)

3 討 論

冠心病是目前導(dǎo)致死亡的主要原因。ACS則是冠心病的一種較為嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)形式，多種因素導(dǎo)致冠狀動脈內(nèi)斑塊糜爛及破裂、血栓形成、血管痙攣，而血管內(nèi)皮功能障礙正是心血管疾病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)和始動因素，其中“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說”認(rèn)為化學(xué)因素、免疫因素等刺激對內(nèi)皮細胞造成損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。因此，尋找一種能夠定量評估內(nèi)皮功能狀態(tài)的指標(biāo)，對于預(yù)測ACS的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。

EMP正是內(nèi)皮細胞激活或凋亡時釋放的一種膜性囊泡。目前普遍認(rèn)為EMP不僅是存在于循環(huán)中的內(nèi)皮細胞脫落的碎片，而且通過其表面不同蛋白分子與靶細胞相互作用起到信息傳遞的作用，并參與到許多與循環(huán)系統(tǒng)疾病相關(guān)的病理生理過程中。近年來，研究發(fā)現(xiàn) EMP 在 ACS［2－5］、糖尿?。?－7］、腎臟疾病［8］、周圍血管?。?］、自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡［10］患者中顯著升高，被認(rèn)為是內(nèi)皮功能障礙的指標(biāo)。EMP能夠利用流式細胞術(shù)定量檢測［11］。不同的表型預(yù)示著EMP的細胞來源不同。CD31抗原是內(nèi)皮細胞源性的特異抗原，CD42抗原是血小板源性的特異抗原，本研究檢測血漿抗CD31陽性、抗CD42陰性的內(nèi)皮微粒的水平，有效排除血小板源性的微粒子影響。結(jié)果顯示造模后兩個時間段 MI組EMP水平均較 Sham組明顯升高，表明EMP可以反映不同時段急性心肌缺血時內(nèi)皮功能障礙的程度。而造模后2h I/R組與Sham組比較無明顯變化，可能與在短時間內(nèi)血管復(fù)通后減少了內(nèi)皮損傷有關(guān)。目前介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)已成為ACS的主要治療手段，極大地改善了患者的預(yù)后。本研究亦提示ACS進行介入治療必需爭分奪秒，盡可能將內(nèi)皮損傷的程度降至最低，對于患者的預(yù)后無疑是有利的。但是心臟介入治療并非所有患者都受益，部分患者并未從中受益，究其原因是在對靶血管行PCI術(shù)后仍存在著緩血流或無復(fù)流現(xiàn)象，或PCI術(shù)后出現(xiàn)缺血再灌注損傷。有研究顯示，罪犯血管內(nèi)的EMP水平在血管疏通后明顯高于外周循環(huán)，提示冠脈即使在再灌注治療成功后仍處于高凝狀態(tài)［12］。介入治療本身同時對血管是一種刺激。血管成形術(shù)后遠端保護裝置中收集的冠脈血樣本中，能監(jiān)測到高濃度的微顆粒;PCI術(shù)后8h，循環(huán)EMP升高，且冠脈內(nèi)EMP水平與“無復(fù)流”相關(guān)［13］。研究證實，無復(fù)流的發(fā)生和發(fā)展的核心機制實際是冠脈微血管內(nèi)皮炎癥和損傷，陸永光等［14］的研究提示EMP可作為評價ACS患者在行PCI后無復(fù)流導(dǎo)致冠脈微血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)和損傷程度的標(biāo)志物，或成為改善I/R損傷的一個新靶點。

細胞凋亡是主動性細胞死亡形式，動物及人的急性心肌缺血過程均可誘導(dǎo)細胞凋亡［15］。大量研究顯示急性心肌缺血等心血管疾病存在細胞凋亡，而細胞凋亡正是導(dǎo)致I/R損傷的重要環(huán)節(jié)之一。本研究顯示造模后2h，MI組及I/R組心肌細胞凋亡率均顯著提高;I/R組CK－MB、cTNT水平略高于MI組亦與再灌注過程中心肌細胞損傷有關(guān)。早期干預(yù)是否能阻斷細胞凋亡，是未來的研究方向。

EMP的臨床應(yīng)用仍有很多局限性。首先目前大部分的證據(jù)源自于橫斷面的研究，前瞻性研究數(shù)據(jù)較少［16］。其次定義EMP的標(biāo)準(zhǔn)表面分子標(biāo)志組合，制訂檢測EMP的標(biāo)準(zhǔn)流程和分析其數(shù)據(jù)變量的標(biāo)準(zhǔn)方法等問題是未來需要關(guān)注的熱點;其它限制如有哪些因素能影響體內(nèi)EMP的變化以及EMP隨采集時間長短的波動程度等。

目前雖然對于有傳統(tǒng)心血管危險因素(如吸煙、高血壓、高血脂、糖尿病等)的患者實行一級預(yù)防和二級預(yù)防，仍未能減少心血管事件的發(fā)生［17］，而EMP在心血管疾病初級預(yù)防的風(fēng)險評估中顯示出它的價值［18］，尤其是對那些處于中度風(fēng)險的患者。有證據(jù)證明在已知心血管疾病的患者中EMP對于復(fù)發(fā)高風(fēng)險個體確定更有價值，能有效提高二級預(yù)防效果和減少心血管事件發(fā)生。展望未來，深入研究若對于心血管風(fēng)險因素的治療，EMP呈現(xiàn)敏感的下降趨勢，它們或許在監(jiān)測治療方面體現(xiàn)價值;若EMP和心血管疾病有因果關(guān)系，它們或?qū)⒊蔀樾碌闹委煱悬c，為臨床心血管病的診治提供新的策略。

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