林家豪，陳睿毅，樓 寶，徐冬冬，詹 煒，毛國(guó)民，等

（1.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；3.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021；4.浙江省樂(lè)清市海洋與漁業(yè)局，浙江樂(lè)清 325600）

17α-甲睪酮對(duì)黃姑魚幼魚生長(zhǎng)及性分化的影響

林家豪1，陳睿毅2，3，樓 寶2，3，徐冬冬2，3，詹 煒2，3，毛國(guó)民2，3，等

（1.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；3.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021；4.浙江省樂(lè)清市海洋與漁業(yè)局，浙江樂(lè)清 325600）

利用不同濃度的17α-甲睪酮（MT）（0.5、1、5、10 μg/L）對(duì)25日齡的雌核發(fā)育黃姑魚進(jìn)行浸浴處理，每日2 h，連續(xù)處理75 d，用以研究MT對(duì)其生長(zhǎng)、死亡率和性分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在雌核發(fā)育黃姑魚孵化后25日齡至100日齡用17α-甲基酮進(jìn)行浸浴處理均可使其轉(zhuǎn)化成偽雄魚。外源性MT對(duì)黃姑魚的生長(zhǎng)有抑制作用，與對(duì)照組差異顯著（P≤0.05），但對(duì)其生存率并無(wú)顯著影響（P≥0.05）；各MT實(shí)驗(yàn)濃度對(duì)雌核發(fā)育黃姑魚幼魚都有性逆轉(zhuǎn)作用，性逆轉(zhuǎn)時(shí)間5 μg/L最早，比正常黃姑魚提前了4 d。

17α-甲睪酮；黃姑魚；性分化

黃姑魚Nibea albifloraRichardson俗稱黃婆雞、黃姑子，隸屬鱸形目Perciformes、石首魚科Sciaenidae、黃姑魚屬Nibea。黃姑魚為暖水性中下層魚類，在我國(guó)沿海均有分布，其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，歷來(lái)是漁民的主要捕撈對(duì)象。但近年來(lái)，由于海洋環(huán)境遭到破壞和漁民的濫捕濫撈，其漁業(yè)資源急劇衰減，野生黃姑魚的產(chǎn)量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求，因此人們開始進(jìn)行人工養(yǎng)殖。在人工養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，雌性黃姑魚要比雄性黃姑魚生長(zhǎng)速度快20%[1]，那么實(shí)現(xiàn)黃姑魚的全雌化養(yǎng)殖對(duì)于黃姑魚的養(yǎng)殖業(yè)就顯得尤為重要。徐冬冬等[2]利用雌核發(fā)育的方法誘導(dǎo)了全雌的黃姑魚苗種，但誘導(dǎo)率極低，不適用于大規(guī)模苗種繁育。而在此基礎(chǔ)上，以雌核發(fā)育黃姑魚為材料，利用17α-甲睪酮（MT）對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得生理雄性、遺傳雌性的偽雄魚，性成熟后再與雌魚交配即可規(guī)?；玫饺泼绶N。

利用雄性激素對(duì)魚類進(jìn)行性別控制的研究早有報(bào)道[3-4]。GRANT等[5]分別利用17α-甲睪酮（MT）和11β-烯二酮（OHA）對(duì)虹鱒Oncorhynchus mykiss進(jìn)行了偽雄魚的誘導(dǎo)研究，結(jié)果表明MT浸泡比OHA（400 μg/L）浸泡可以獲得更高的雄性率。KERSTIN等[6]對(duì)1齡烏鰭石斑魚Epinephelus marginatus進(jìn)行MT（11 mg/kg）植入，12周后觀察到其發(fā)生性轉(zhuǎn)變。MERCEDES等[7]用MT含量為10 mg/kg的飼料飼喂歐洲鱸魚Dicentrarchus labrax，發(fā)現(xiàn)從126日齡開始飼喂。連續(xù)飼喂100可以獲得93%～100%的雄性率，而晚于該階段雄性率則不會(huì)出現(xiàn)顯著變化。FEIST等[8]對(duì)虹鱒進(jìn)行MT浸泡與MT浸泡與投喂相結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果通過(guò)浸泡與投喂相結(jié)合性轉(zhuǎn)化成的偽雄魚通常沒(méi)有輸精管，而單獨(dú)浸泡MT產(chǎn)生的偽雄魚通常具有輸精管。雌性激素也常用來(lái)誘導(dǎo)魚類雌性化的產(chǎn)生[9]。YAMAMOTO[10]利用17β-雌二醇采用浸泡法對(duì)雌核發(fā)育牙鲆Paralichthys olivaceus進(jìn)行了雌性誘導(dǎo)的研究，獲得了100%的雌性率。由此可見(jiàn)，無(wú)論是浸泡法，還是飼喂法，利用外源激素均能達(dá)到性別控制的目的，但是浸泡法更有利于輸精管的形成。

目前，尚未有關(guān)于雄性激素對(duì)黃姑魚性別分化與生長(zhǎng)影響的相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過(guò)MT浸泡雌核發(fā)育黃姑魚稚魚，觀察實(shí)驗(yàn)魚性分化與生長(zhǎng)等性狀，檢驗(yàn)甲睪酮是否會(huì)對(duì)幼魚產(chǎn)生影響，以期為今后黃姑魚偽雄魚制備提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2014年6月份于浙江省海洋水產(chǎn)研究所西閃試驗(yàn)場(chǎng)，參考徐冬冬等[2]的方法制備雌核發(fā)育黃姑魚。用500 L的玻璃鋼水槽進(jìn)行孵化、養(yǎng)殖，水溫21±0.5℃，鹽度20～21，水深30 cm。試驗(yàn)前期投喂輪蟲、豐年蟲和橈足類，25日齡（4.363 3±0.004 6 g，0.688 9±0.004 8 cm）時(shí)開始投喂配合飼料，早中晚3次，定時(shí)投喂，飽食。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)采用雄性激素浸泡法，設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行150尾魚苗，激素濃度分別為0.5、1、5和10 μg/L，1個(gè)陰性對(duì)照組，用同濃度的乙醇處理；1個(gè)空白對(duì)照組，不做任何處理。MT（1 g，純度：≥95%，Matrix）購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司，先用分析純無(wú)水乙醇溶解，配置成1×105μg/L的母液。每天下午2點(diǎn)開始浸泡，持續(xù)2 h，按不同激素濃度添加不同體積的激素母液，浸泡結(jié)束后，充分換水，保證激素?zé)o殘留。從25日齡開始取樣，每5天取樣1次，至100日齡結(jié)束。測(cè)量其體重和全長(zhǎng)后，置于玻恩氏液中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明和石蠟包埋后，作連續(xù)切片，切片厚度為5～8 μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡（LEICA DM4000B顯微鏡，Shineso MIC型顯微圖像分析系統(tǒng)）觀察拍照鑒定其性別。

1.3 分析方法

利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件的One-Way ANOVA的分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 17α-甲睪酮對(duì)黃姑魚生長(zhǎng)的影響

從圖1可以看出，在外源MT的影響下，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組黃姑魚的體重均受到不同程度的抑制，其中尤以10 μg/L激素濃度下抑制最為明顯，70日齡后體重增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯減緩；其平均特定增長(zhǎng)率僅為3.51 g，遠(yuǎn)小于對(duì)照組4.14 g（表1）。黃姑魚在30日齡時(shí)，體重與全長(zhǎng)均未存在顯著差異；70日齡時(shí)，空白組和對(duì)照組無(wú)顯著差異，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的體重均與空白組和對(duì)照組存在顯著差異（P≤0.05），且0.5、1和5 μg/L 3組與10 μg/L組也存在顯著差異；100日齡時(shí)，10 μg/L處理組的體重遠(yuǎn)小于其它組，且差異性顯著（P≤0.05）（表1）。

圖1 17α-甲睪酮對(duì)黃姑魚生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of 17α-Methyltestosterone onN.albifloragrowth

表1 17α-甲睪酮對(duì)黃姑魚生長(zhǎng)影響的顯著性檢驗(yàn)Tab.1 Results of chi-squared analyses for growth after 17α-Methyltestosterone treatment

2.2 17α-甲睪酮對(duì)黃姑魚死亡率的影響

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)黃姑魚出現(xiàn)死亡，累計(jì)死亡率見(jiàn)表2，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率均低于9%。方差分析結(jié)果顯示，各組之間的死亡數(shù)并無(wú)顯著差異，表明MT的處理并未對(duì)黃姑魚的死亡產(chǎn)生顯著影響（P≥0.05）。

表2 17α-甲睪酮處理后黃姑魚的累計(jì)死亡率Tab.2 The cumulative mortalities ofN.albifloraup to 100 days after 17α-Methyltestosterone treatment

表3 17α-甲睪酮處理后黃姑魚累計(jì)死亡數(shù)的方差分析Tab.3 Results of one-way ANOVA forN.albifloracumulative mortalities after 17α-Methyltestosterone tretment

2.3 17α-甲睪酮對(duì)黃姑魚性分化的影響

黃姑魚25日齡與30日齡的性腺橫切片中，各實(shí)驗(yàn)組無(wú)區(qū)別，都觀察到黃姑魚原始性腺出現(xiàn)，位于魚鰾下方與腸管之間，左右各有一個(gè)原始性腺（圖2：a）。40日齡時(shí)，對(duì)照組和空白組的性腺橫切片觀察到黃姑魚生殖細(xì)胞和體細(xì)胞通過(guò)有絲分裂大量增殖，向性腺腹腔聚攏，形成卵巢腔的雛形（圖2：c），從細(xì)胞學(xué)上證明這種性腺已決定并向卵巢方向分化。

在45日齡的黃姑魚性腺橫切片中，5 μg/L激素處理組觀察到壺腹?fàn)畹妮斁茉?、精原?xì)胞，精母細(xì)胞和血管（圖2：f）。

在55日齡的黃姑魚性腺橫切片中，0.5 μg/L激素處理組和1 μg/L激素處理組黃姑魚首次觀察到呈壺腹?fàn)畹妮斁茉罢呔哂休^多精原細(xì)胞，還觀察到血管和很少一部分周邊核仁期的卵母細(xì)胞（圖2：d）；后者體積明顯較大，具有一定數(shù)量的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，若干個(gè)周邊核仁期的卵母細(xì)胞（圖2：e）。

在80日齡的黃姑魚性腺橫切片中，10 μg/L激素處理組黃姑魚中同時(shí)具有輸精管、精小葉、精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和較多數(shù)量的周邊核仁期的卵母細(xì)胞（圖2：h）。

100日齡時(shí)，空白組與對(duì)照組的性腺橫切片示卵巢（圖2：i-j）；各激素濃度組（0.5、1、5和10 μg/L）的性腺橫切片皆示精巢（圖2：k-n）。

圖2 黃姑魚性分化過(guò)程Fig.2 Sex differentiation process ofN.albiflora

3 討論

3.1 對(duì)生長(zhǎng)的影響

性類固醇激素具有調(diào)節(jié)腦垂體刺激生長(zhǎng)激素分泌的作用[6]，而魚類生長(zhǎng)激素是在魚類機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育起關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)因子，可以刺激組織發(fā)育，影響魚類生長(zhǎng)[11]。研究表明[12]，對(duì)60 pdf的黑鱸Dicentrarchus labrax進(jìn)行投喂MT（10 mg/kg），200 d后其平均體重比對(duì)照組低55%，差異顯著（P≤0.05）。無(wú)獨(dú)有偶，JORDI等[13]發(fā)現(xiàn)每天投喂OHA含量為10 mg/kg的飼料，塞內(nèi)加爾鰨Solea senegalensis的生長(zhǎng)受到明顯的抑制。本實(shí)驗(yàn)中，空白組和對(duì)照組的黃姑魚生長(zhǎng)并無(wú)顯著差異，因此可以排除其受到乙醇影響的可能。在30日齡時(shí)，黃姑魚體重與全長(zhǎng)無(wú)顯著差異，而在養(yǎng)至70和100日齡時(shí)，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的體重與全長(zhǎng)均小于對(duì)照組，且差異顯著（P≤0.05），表明養(yǎng)殖水體中添加MT會(huì)抑制黃姑魚早期的生長(zhǎng)。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組（0.5、1和5 μg/L）的生長(zhǎng)雖低于空白組和對(duì)照組，但3組之間并無(wú)顯著差異（P≥0.05），表明在一定濃度范圍內(nèi)，隨著MT濃度的升高，黃姑魚的生長(zhǎng)不會(huì)受到影響。而高濃度（10 μg/L）處理組的特定生長(zhǎng)率最小，尤其在70日齡后，體重增長(zhǎng)極為緩慢，推測(cè)原因可能是高濃度的外源激素影響黃魚類的攝食和代謝能力，從而抑制魚體生長(zhǎng)[14]。

3.2 對(duì)死亡率的影響

有研究表明，當(dāng)激素濃度在某一范圍內(nèi)時(shí)對(duì)魚類成活率無(wú)顯著影響，但在超過(guò)某個(gè)閾值后，魚類的成活率將會(huì)顯著降低[12]。KNORR等[15]對(duì)日本青鳉Oryzias latipes進(jìn)行辛基酚處理發(fā)現(xiàn)，當(dāng)處理濃度≥2 μg/L時(shí)死亡率升高20%～30%。同樣，在誘導(dǎo)香魚性轉(zhuǎn)換的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著苯甲酸強(qiáng)力春情素濃度的增加，其死亡率也逐步升高[16-17]。本研究中，各組死亡率雖高于5%，但并未出現(xiàn)顯著差異（P≥0.05），可見(jiàn)MT激素濃度在黃姑魚耐受范圍內(nèi)，對(duì)其成活率不會(huì)造成影響。

3.2 對(duì)性分化的影響

研究表明，魚類性腺受內(nèi)源性激素的影響[18]。而外源激素MT則會(huì)影響卵巢的進(jìn)一步發(fā)育，這一結(jié)論已在斑馬魚中得到證實(shí)[18-19]。利用MT與11β-羥雄烯二酮（OHA）均能誘導(dǎo)雌性虹鱒魚性逆轉(zhuǎn)為雄性虹鱒魚[6,20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)4個(gè)不同激素濃度組處理雌核發(fā)育黃姑魚的性腺分化情況進(jìn)行組織學(xué)觀察，結(jié)果表明100日齡時(shí)，4個(gè)激素處理組的性腺至均發(fā)育為精巢，雄性率為100%；而對(duì)照組和空白組則發(fā)育為卵巢，雄性率為0。但各組性腺分化時(shí)間并不同步，且在一定時(shí)間段內(nèi)出現(xiàn)了雌雄間體的現(xiàn)象（圖2：（d）（e）（g）(h)）。本實(shí)驗(yàn)中，0.5 μg/L激素濃度下，黃姑魚55日齡的性腺可同時(shí)觀察到卵母細(xì)胞和輸精管原基，表明外源MT對(duì)卵母細(xì)胞有抑制作用，且促進(jìn)雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育，這與卓孝磊等[20]的研究結(jié)果相似。張曉彥等[21]報(bào)道，17β-雌二醇處理后半滑舌鰨卵巢分化提前了7 d。而在本實(shí)驗(yàn)中，5 μg/L激素濃度下，黃姑魚45日齡性腺開始向精巢轉(zhuǎn)化，較對(duì)照組的黃姑魚雄性性腺分化時(shí)間提前了4 d。

上述研究結(jié)果表明，在雌核發(fā)育黃姑魚孵化后25日齡至100日齡用17α-甲基酮進(jìn)行浸浴處理均可使其轉(zhuǎn)化成偽雄魚。同時(shí)外源MT對(duì)黃姑魚的生長(zhǎng)有抑制作用，但對(duì)其生存率無(wú)影響，而對(duì)其性腺分化有影響。

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Effects of 17α-Methyltestosterone on Growth and Sex Differentiation in Nibea albiflora

LIN Jia-hao1,CHEN Rui-yi2,3,LOU Bao2,3,et al
(1.Fishery School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022;2.Zhejiang Marine Fisheries Research Institute,Zhoushan 316021;3.Zhejiang Key Lab of Mariculture&Enhancement,Zhoushan 316021,China)

In order to study on the effects of 17α-methyltestosterone on growth,mortality and sex differentiation inNibea albiflora,the Gynogenetic larval(N.albiflora)on 25 days post hatching were treated in 17α-Methyltestosterone(0.5,1,5,10 μg/L)for 2 hours each day and lasted for 75 days.The results showed that GynogeneticN.albifloracould convert into pseudo-male after 75 days treatment with MT.Meanwhile,exogenous MT had an inhibiting effect on the growth ofN.albiflora,weight gain of which was significantly lower than that in the control group(P≤0.05),however,survival was not affected by exogenous MT(P≥0.05).The MT concentration for each experiment can reversal Gynogenetic croaker juveniles is sex,the treatment group 5 μg/L reversal sex earliest and 4 days earlier than the normalNibea.

17α-Methyltestosterone;Nibea albiflora;sex differentiation

S917.4

A

1008－830X(2015)01－0020－06

2014-10-10

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012C12907-8；2013F20001）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2012AA10A413）

林家豪（1993-），女，浙江溫嶺人，碩士研究生，研究方向：安全養(yǎng)殖工藝與技術(shù).

樓寶，研究員.E-mail:loubao6577@163.com