王 化，周麗萍，李夢(mèng)莎，朱良玉，張 悅*

1黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所;2東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040

圖1 橄欖苦苷分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Chemical structure of oleuropein

橄欖苦苷(Oleuropein)是一種無毒的裂環(huán)烯醚萜苷類化合物(見圖1)，是暴馬丁香的主要活性成分之一。近年來，國內(nèi)、外學(xué)者對(duì)橄欖苦苷的研究不斷深入，已發(fā)現(xiàn)其諸多藥理活性，主要包括:抗氧化［1］、抗炎［2］、抗動(dòng)脈粥樣［3］、抗癌［4］、抗病毒等活性，及對(duì)心臟損害的保護(hù)［5］、降糖［6］、降血脂作用［7］，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。

目前橄欖苦苷的提取方法主要為溶劑浸提法、超聲提取法和微波提取法［8-10］，未見應(yīng)用表面活性劑輔助提取的研究報(bào)道。實(shí)驗(yàn)采用的烷基糖苷(APG)類化合物是由葡萄糖和天然脂肪醇合成的一種性能較全面的新型非離子表面活性劑，兼具陰離子和普通非離子表面活性劑的特性，具有較高表面活性和相溶性，更重要的是具有良好的生態(tài)安全性，安全無毒、易降解，是當(dāng)今國際公認(rèn)的首選“綠色”功能性表面活性劑［11］。研究烷基糖苷類表面活性劑對(duì)于輔助提取暴馬丁香樹枝中橄欖苦苷的影響，考察不同因素與目的產(chǎn)物得率的關(guān)系，得出最佳提取工藝參數(shù)，為實(shí)現(xiàn)節(jié)能環(huán)保的橄欖苦苷工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與儀器

暴馬丁香樹枝于2014年5 月采集于東北林業(yè)大學(xué)，60 ℃干燥，并通過粉碎機(jī)粉碎至40 目，置于陰涼干燥處備用;橄欖苦苷對(duì)照品(≥98%，AW7860，天津一方科技有限公司);烷基糖苷系列表面活性劑(≥50%，臨沂市蘭山區(qū)綠森化工有限公司);甲醇(色譜純)，乙醇(分析純)，去離子水自制。

超聲波清洗器(KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司);Waters e2695-2998 高效液相色譜檢測系統(tǒng);C18色譜柱(4.6mm × 150mm，5 μm，Waters 公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 橄欖苦苷含量測定方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備

精確稱取橄欖苦苷對(duì)照品4 mg，用甲醇溶解并定容于1 mL 量瓶中，得橄欖苦苷質(zhì)量濃度為4 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密稀釋為濃度2、1、0.4、0.2、0.1、0.04、0.02 mg/mL 的工作溶液。

2.1.2 樣品制備

分別稱取暴馬丁香樹枝粉末1.00 g，置于50 mL 燒杯中，各加入一定體積的不同濃度含有烷基糖苷系列表面活性劑的乙醇溶液，放置于超聲波輔助提取器中進(jìn)行提取，提取完成后將提取液1 mL 于離心管中，12000 rpm，離心15 min，取上清液體置于液相進(jìn)樣瓶中，待測。

2.1.3 HPLC 色譜條件

柱溫30 ℃，流動(dòng)相甲醇-0.5%磷酸水溶液(36∶64)，檢測波長205 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，橄欖苦苷出峰時(shí)間為16.174 min。

2.1.4 橄欖苦苷得率計(jì)算

橄欖苦苷得率(%)=橄欖苦苷質(zhì)量(g)/暴馬丁香樣品質(zhì)量(g)×100% 。

2.2 橄欖苦苷提取的單因素試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中選取了6 個(gè)因素分別為:APG 型號(hào)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、APG 添加量、提取溫度、提取時(shí)間、料液比，分別改變以上6 個(gè)因素進(jìn)行超聲波法提取試驗(yàn)。

2.2.1 APG 型號(hào)

稱取暴馬丁香樹枝粉末1.00 g，按照溫度為40℃，料液比例1∶15 g/mL，在體積分?jǐn)?shù)為45%的乙醇溶液中分別加入APG06、APG08、APG10、APG0810、APG0814，添加量為0.5%，超聲提取時(shí)間40 min，提取液經(jīng)離心后進(jìn)行HPLC 檢測，按公式計(jì)算橄欖苦苷得率，重復(fù)3 次。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)

稱取暴馬丁香樹枝粉末1.00 g，按照溫度為40℃，料液比例1∶15 g/mL，分別在體積分?jǐn)?shù)為0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中加入APG0810，添加量為0.5%，超聲提取時(shí)間40 min，提取液經(jīng)離心后進(jìn)行HPLC 檢測，按公式計(jì)算橄欖苦苷得率，重復(fù)3 次。

2.2.3 APG 添加量

稱取暴馬丁香樹枝粉末1.00 g，按照溫度為40℃，料液比例1∶15 g/mL，在體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中加入APG0810，添加量分別為0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%，超聲提取時(shí)間40 min，提取液經(jīng)離心后進(jìn)行HPLC 檢測，按公式計(jì)算橄欖苦苷得率，重復(fù)3 次。

2.2.4 提取溫度

稱取暴馬丁香樹枝粉末1.00 g，按照料液比例1 ∶15 g/mL，提取溶劑為80% 的乙醇溶液中添加0.5%的APG0810，超聲溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃，提取時(shí)間40 min，提取液經(jīng)離心后進(jìn)行HPLC 檢測，按公式計(jì)算橄欖苦苷得率，重復(fù)3 次。

2.2.5 料液比例

稱取暴馬丁香樹枝粉末1.00 g，按照提取溶劑為80%的乙醇溶液中添加0.5%的APG0810，超聲溫度40 ℃，料液比例分別為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1∶25、1∶30 g/mL，提取時(shí)間40 min，提取液經(jīng)離心后進(jìn)行HPLC 檢測，按公式計(jì)算橄欖苦苷得率，重復(fù)3次。

2.2.6 提取時(shí)間

稱取暴馬丁香樹枝粉末1.00 g，按照提取溶劑為80%的乙醇溶液中添加0.5%的APG0810，超聲溫度40 ℃，料液比例為1∶20 g/mL，提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min，提取液經(jīng)離心后進(jìn)行HPLC 檢測，按公式計(jì)算橄欖苦苷得率，重復(fù)3 次。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化橄欖苦苷提取工藝

在橄欖苦苷單因素提取試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，根據(jù)Design-Expert 8.0.6 中Box-Benhnken 設(shè)計(jì)原理，選取影響橄欖苦苷得率的3 個(gè)主要因素:乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels in the response surface design

3 結(jié)果與討論

3.1 橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)HPLC 結(jié)果可以得出橄欖苦苷質(zhì)量(X)與峰面積(Y)的線性關(guān)系擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線公式:Y=30087930X +1212258(R2=0.9992)，線性范圍0.02～4.00 mg/mL。橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品與樣品高效液相色譜圖如圖2 所示。

圖2 橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品(a)及暴馬丁香樹枝提取液(b)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of oleuropein standard (a)and S.amurensis branch (b)

3.2 不同單因素對(duì)橄欖苦苷提取得率的影響

6 個(gè)不同因素對(duì)橄欖苦苷提取得率的影響如圖3 所示。

5 種不同型號(hào)APG 添加到乙醇中輔助提取橄欖苦苷結(jié)果見3a。APG06、APG08 和APG10 三種型號(hào)烷基糖苷表面活性劑的添加并未顯著提高橄欖苦苷的得率，而APG0810、APG0814 均明顯提高了橄欖苦苷的得率，與乙醇提取得率相比分別提高了7.45%、5.21%，表明含有復(fù)合碳素分布的烷基糖苷化合物比僅含有單一碳素分布的烷基糖苷化合物更易降低固-液相界面張力，增大有機(jī)物質(zhì)的溶解、滲出能力，提高提取率。因此，選取APG0810 輔助提取橄欖苦苷。

圖3b 為體積分?jǐn)?shù)為0～100%乙醇溶液進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)的結(jié)果。乙醇體積分?jǐn)?shù)為80% 時(shí)，橄欖苦苷得率最高可達(dá)3.94%;乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時(shí)，得率反而下降。原因是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，溶劑與橄欖苦苷極性相近，當(dāng)超過體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)，溶劑的極性降低，導(dǎo)致橄欖苦苷得率也降低。因此，響應(yīng)面試驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)70%～90%的乙醇。

選擇不同APG0810 添加量試驗(yàn)結(jié)果如圖3c 所示。當(dāng)APG0810 添加量達(dá)到0.5%時(shí)，橄欖苦苷提取效果已達(dá)到較好水平——3.94%，再增加添加量對(duì)橄欖苦苷得率無顯著影響。APG0810 用量太大，不僅會(huì)增加生產(chǎn)的成本，還會(huì)使生產(chǎn)過程中產(chǎn)生較多泡沫，增加分離難度，因此選取添加0.5% 的APG0810 較為適宜。

由圖3d 可見，在20～40 ℃范圍內(nèi)，橄欖苦苷得率隨提取溫度升高而顯著增加，40～60 ℃之間橄欖苦苷得率緩慢增加，因此，響應(yīng)面試驗(yàn)選擇提取溫度為40～60 ℃進(jìn)行。

改變料液比例進(jìn)行超聲提取試驗(yàn)，得到結(jié)果如圖3e 所示。料液比例在1∶10～1∶20 g/mL 范圍之內(nèi)，橄欖苦苷得率顯著提高，其原因可能為隨料液比例的增加，橄欖苦苷的傳質(zhì)動(dòng)力也增加，使原料粉末中更多的橄欖苦苷融入乙醇中。當(dāng)料液比例繼續(xù)升高時(shí)，橄欖苦苷得率沒有顯著變化。以節(jié)約溶劑因素考慮，將提取料液比例設(shè)定為1∶20 g/mL。

圖1 APG 型號(hào)(a)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(b)、APG0810 添加量(c)、提取溫度(d)、料液比(e)及提取時(shí)間(f)對(duì)橄欖苦苷得率的影響Fig.1 Effects of APG types (a)，ethanol concentration (b)，adding amount of APG0810 (c)，extraction temperature (d)，solid/liquid ratio (e)and extraction time (f)on the extraction yields of oleuropein

圖3f 為提取時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果。在設(shè)定時(shí)間范圍內(nèi)，橄欖苦苷得率一直隨提取溫度升高而增加，提取時(shí)間60 min 時(shí)，橄欖苦苷得率最高達(dá)4.52%，但提取40 min 時(shí)，橄欖苦苷得率為4.29%，兩者之間未達(dá)到顯著性差異，建議考慮生產(chǎn)中時(shí)間和超聲能量的消耗，將響應(yīng)面試驗(yàn)提取時(shí)間定為30～50 min。

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化橄欖苦苷提取工藝條件

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)響應(yīng)值(橄欖苦苷得率/Y)與各因素(乙醇體積分?jǐn)?shù)/A、提取溫度/B、提取時(shí)間/C)進(jìn)行回歸擬合，得到橄欖苦苷提取得率回歸方程:

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and experimental result of response surface methodology

序?yàn)?乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞提取溫度。

橄欖苦苷提取得率的回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表3所示。擬合方程的各個(gè)變量對(duì)橄欖苦苷的得率影響的顯著程度可以通過P 值進(jìn)行判斷［12］。P 的值越小，表明對(duì)應(yīng)變量影響的顯著性水平越高，當(dāng)P≤0.05 時(shí)達(dá)到顯著水平，P≤0.01 時(shí)達(dá)到極顯著水平。此方程P＜0.01，表明回歸模型具有顯著性。失擬項(xiàng)F=1.08，P=0.4527＞0.05，表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，擬合效果好。各因素對(duì)提取暴馬丁香中橄欖苦苷得率的影響大小順序?yàn)?乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞提取溫度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

由二次回歸模型得到三個(gè)響應(yīng)曲面圖，見圖4。橄欖苦苷得率的響應(yīng)曲面均為開口向下凸面，且中心在考察區(qū)域之內(nèi)，表明在考察區(qū)域范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的最大值。通過Design-Expert 軟件分析，提取暴馬丁香中橄欖苦苷的最佳條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)81.62%，提取溫度54.61 ℃，提取時(shí)間46.43 min，橄欖苦苷得率為4.48%。

圖4 各因素對(duì)橄欖苦苷得率的影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots showing interactive effects of different factors on the yield of oleuropein

對(duì)優(yōu)化所得最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為方便操作，選取各條件臨近整數(shù)值，具體為:稱取暴馬丁香樹枝粉末1.00 g，按照提取溶劑為80%的乙醇溶液中添加0.5%的APG0810，超聲提取溫度55 ℃，料液比例為1∶20 g/mL，提取時(shí)間為46 min，提取液經(jīng)離心后進(jìn)行HPLC 檢測，計(jì)算橄欖苦苷得率，重復(fù)5次。實(shí)際測得橄欖苦苷得率為4.41±0.11%，與模型預(yù)測值之間誤差為1.59%。

4 結(jié)論

辛癸基葡糖苷輔助提取暴馬丁香樹枝中橄欖苦苷的優(yōu)化工藝條件為:提取溶劑為80%的乙醇溶液中添加0.5%的APG0810，超聲提取溫度55 ℃，料液比例為1∶20 g/mL，提取時(shí)間為46 min，橄欖苦苷得率為4.41±0.11%。

暴馬丁香中橄欖苦苷的高效制備技術(shù)研究既可以為醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域提供新的植物資源，又能為暴馬丁香資源的精深加工利用提供技術(shù)支持，促進(jìn)暴馬丁香資源合理利用基礎(chǔ)上，開發(fā)高值化產(chǎn)品，有利于推動(dòng)林下經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

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