徐秀娟 ，王 甜，何保江，李國棟，秦廣雍，屈 展，胡 軍，卓浩廉

1中國煙草總公司鄭州煙草研究院;2 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心;3 鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院，鄭州 450000;4 廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，廣州 510385

天然產(chǎn)物分離過程中常用的提取分離技術(shù)有水蒸氣蒸餾、樹脂吸附法、超臨界萃取法、亞臨界萃取、分子蒸餾法等［1，2］。水蒸氣蒸餾是提取植物精油最常見的方法，適用于具有揮發(fā)性、耐高溫且在水中穩(wěn)定存在的植物有效組分的提取分離。亞臨界萃取技術(shù)是利用亞臨界流體擴散能力強、傳質(zhì)速度快等特點，將物料中特定極性的成分溶出［3，4］。與超臨界萃取相比，具有條件溫和，工作壓力低，物料不易氧化等優(yōu)點，因而在天然植物有效成分的提取、天然色素、特種油脂的提取等方面應(yīng)用廣泛。分子蒸餾是一種在高真空度下進行分離操作的連續(xù)蒸餾過程，它是利用不同分子平均自由程的差異導(dǎo)致其表面蒸發(fā)速率不同而實現(xiàn)分離［2］。具有蒸餾溫度低、真空度高、物料受熱時間短等優(yōu)點，在食品、醫(yī)藥、日化、香料等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用［5］。

滁菊是菊科植物菊的干燥頭狀花序，位居我國四大名菊(滁菊、杭菊、懷菊、亳菊)之首。素有“金心玉瓣，翠蒂天香”之美譽，性溫和，氣味清香。傳統(tǒng)研究認為滁菊具有散風(fēng)清熱、清肝明目的作用，可用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、眼目昏花等病癥，是藥、食兩用的佳品。部分藥理學(xué)研究結(jié)果表明，滁菊中含有黃酮、揮發(fā)油、多糖、酚酸等多種活性物質(zhì)，具有很好的應(yīng)用開發(fā)價值［6］。目前，對菊花類凈油的成分分析已有較多報道，菊花凈油中富含萜烯類、醇類、酯類等物質(zhì)，在卷煙中可凸顯卷煙的清甜香［7-10］。已報道的菊花類凈油均采用水蒸氣蒸餾法，菊花中揮發(fā)油因提取方法不同，其化學(xué)成分及在卷煙中的效果均會有差異。但目前對不同提取方法所得滁菊凈油揮發(fā)性成分的差異性分析，及在卷煙中的應(yīng)用還未見報道，尤其是通過分子蒸餾的方法制備滁菊凈油還未見報道。本文以滁菊為原料，通過減壓水蒸氣蒸餾、亞臨界萃取技術(shù)、分子蒸餾技術(shù)制備滁菊凈油，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析其化學(xué)成分的差異，并對三種凈油在卷煙加香中的效果進行研究，以期為天然煙用香料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2013年滁菊1 號樣品(安徽省滁州市滁菊研究所);七匹狼(白)空白卷煙。

丁烷(≥99%，中油化工有限公司);95%乙醇(AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);乙酸乙酯(AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);乙酸苯乙酯(99%，阿拉丁試劑(中國)有限責(zé)任公司);液氮(河南源正科技發(fā)展有限公司);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

ST-04 多功能粉碎機(浙江省永康市帥通電器廠);7890GC-8975MS 氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀(美國安捷倫公司);CBE-5L 型亞臨界提取裝置(河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司);DLSB-5L/-20 ℃低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城儀器有限公司);R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi);V-700 隔膜真空泵(瑞士Buchi);V-850 真空控制器(瑞士Buchi);分子蒸餾設(shè)備KDL 5(德國UIC);CIJECToR 型自動注射加香儀(德國Burghart 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 減壓水蒸氣蒸餾

稱取滁菊100 g，粉碎至100 目，轉(zhuǎn)移至2 L 的圓底燒瓶中，加入1000 mL 的沸水，密閉浸泡10 min后冷卻，將滁菊連同浸提物在水浴50 ℃，3 kPa 條件下進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。收集到餾分400 mL 后，再次向燒瓶內(nèi)添加800 mL 沸水，重復(fù)上述實驗步驟，待一共收集到1300 mL 餾分后停止蒸餾。用650 mL 乙酸乙酯萃取收集的餾分3 次，合并有機層，在35 ℃，5 kPa 條件下濃縮至10 g，添加100 mL 95%食用乙醇，再次在相同條件下濃縮至10 g，重復(fù)添加乙醇3次后，將提取物濃縮得到0.13 g，即為滁菊凈油1#，產(chǎn)率0.13%。

1.2.2 亞臨界萃取

稱取滁菊200 g，粉碎至100 目，裝入5 L 亞臨界萃取釜中，抽真空，注入丁烷，料液比為10∶1，在35 ℃下提取30 min，提取完畢后，將液體溶劑抽進蒸發(fā)罐，對物料和浸提液進行脫除溶劑處理，溶劑快速揮發(fā)，完成提取物和萃取溶劑的分離，物料分離后再循環(huán)提取2 次，合并得到滁菊亞臨界粗提取物15.54 g。由于粗提物中含有蠟質(zhì)等不溶物，因而采用乙醇回溶、冷凍脫蠟的方法制備凈油。向粗提物中加入10 倍量95%乙醇，并在50 ℃下加熱回溶2 h，待其冷至室溫后于-20 ℃條件下冷凍24 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，得到6.73 g，即為滁菊凈油2#，產(chǎn)率為3.37%。

1.2.3 分子蒸餾

稱取亞臨界萃取所得滁菊凈油80 g，通過分子蒸餾的方法分離輕組分，分子蒸餾條件:壓力10-2mbar，蒸餾溫度為80 ℃，刮板轉(zhuǎn)速160 rpm，進料速度2.5 mL/min。待進料結(jié)束后，收集輕組分即可得到滁菊凈油3#，共得產(chǎn)物11.87 g，產(chǎn)率14.84%，總產(chǎn)率為0.5%。

1.3 滁菊揮發(fā)油的GC/MS 分析

分別稱量50 mg 的滁菊凈油，用乙醇溶解定容至10 mL，加入3.280 mg 乙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)，進行GC/MS 分析，分析條件如下:

色譜柱:DB-5MS 毛細管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);進樣口溫度:250 ℃;載氣:高純氦氣;流速1.0 mL/min;進樣量:1 μL;分流比10∶1;程序升溫:50 ℃保持1 min，以10 ℃/min 升至200 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升至260 ℃，保持5 min。

電離方式:EI;離子源溫度:230 ℃;電子能量:70 eV;四級桿溫度:150 ℃;電子倍增器電壓:1.89 kV;質(zhì)量掃描范圍33～500 amu;掃描方式:全掃描;溶劑延遲:7.0 min。

1.4 定性及定量方法

參考各化合物的保留時間，對每個色譜峰進行譜庫(NIST08 和WILEY)檢索，確定滁菊揮發(fā)油的各化學(xué)成分;對于鑒定出的成分，以乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)，采用“單一內(nèi)標(biāo)校正法”進行定量，假定相對校正因子為1，含量按以下公式計算:

式中:Ms—內(nèi)標(biāo)乙酸苯乙酯的質(zhì)量(mg);Mi—i組分所屬的凈油的質(zhì)量(mg);Ai—i 組分的峰面積;As—內(nèi)標(biāo)乙酸苯乙酯的峰面積。

1.5 加香［11］與評吸

挑選重量和吸阻均勻一致的七匹狼(白)空白卷煙樣品，用自動注射加香儀分別將質(zhì)量濃度為1%的滁菊凈油1#、2#、3#(95%食用乙醇稀釋)注入空白卷煙中，注射量2 μL/支，開始和結(jié)束注射點距煙絲端分別為5 mm 和55 mm。注射完畢后，將卷煙裝入煙盒中，密封于22±2 ℃和RH 60%±5%條件下放置1 周。請專業(yè)人員分別從香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、刺激性和余味等方面對加香效果進行評價，對照樣煙為加入等量95%食用乙醇的七匹狼(白)空白卷煙。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種滁菊凈油成分分析

按照上述GC/MS 條件對不同方法制備的滁菊凈油進行分析，通過檢索標(biāo)準譜庫(NIST08 和WILEY275)及人工解析圖譜相結(jié)合的方式確定化合物，所得分析結(jié)果如表1 所示。三種凈油中共鑒定出79 種化學(xué)成分，主要包括有機酸類8 種、酮類14種、醇類18 種、烯烴類25 種、酯類7 種，以及其他化合物等。制備方法不同，所含成分數(shù)目及種類略有差異，其中減壓水蒸氣蒸餾共鑒定出65 種化合物，亞臨界萃取和分子蒸餾分別鑒定出60 和63 種，三種凈油中共有的成分有47 種。從表1 中可見，滁菊凈油中含量較高的是龍腦、β-芹子烯、β-倍半水芹烯、(E)-β-金合歡烯、蒿酮、馬兜鈴環(huán)氧化物等，這與文獻報道的結(jié)果相一致［12］。

醇類物質(zhì)中含有龍腦、桃金娘烯醇、α-紫羅蘭醇、檀香醇、二氫芳樟醇、2-乙基己醇、橙花叔醇、桉油烯醇、2-羥基桉樹腦、α-松油醇等，其中龍腦、桃金娘烯醇具有清涼的、薄荷的藥草氣息;檀香醇具有甜而溫和的木香，且香氣持久;α-松油醇能與煙草的香味協(xié)調(diào)，賦予果香與辛香，改善煙氣;橙花叔醇在煙草中可增加蜜甜、花香、果香的香韻，改善吃味［7］。烯烴類共25 種，占總揮發(fā)物質(zhì)的32.87%～44.22%，包括β-芹子烯、α-姜黃烯、(E)-β-金合歡烯、β-倍半水芹烯、α-蒎烯、月桂烯、長葉烯、β-甜沒藥烯等，在卷煙中可能具有抗氧化或抑制煙氣自由基的作用［10］。α-蒎烯具有松木、針葉及樹脂樣的氣息，香氣透發(fā);(E)-β-金合歡烯具有特殊的青香韻的鈴蘭花香氣，并伴隨有木香香韻［13］;β-甜沒藥烯具有愉悅的甜香、花香氣息［14］。酮類物質(zhì)的含量僅次于烯烴類和醇類，占總揮發(fā)物的7.19%～12.86%，其中的樟腦、菊油環(huán)酮、植酮、香芹艾菊酮等在文獻中已有報道［12］，是菊花揮發(fā)油中常見的酮類化合物，樟腦具有竄透性的特異芳香;6-甲基-5-庚烯-2-酮具有強烈的青香、柑橘樣的香氣，在卷煙中可修飾果香，增添清香，烘托上等煙獨具的風(fēng)味。滁菊凈油中有機酸的含量相對較少，且?guī)缀鮾H存在于1#凈油中，異丁酸、異戊酸等能在煙草制品中增添水果和乳酪樣甜香，使煙氣醇和，增強香料煙的風(fēng)格。酯類化合物中的乙酸薄荷酯、乙酸葉醇酯、乙酸龍腦酯等均可增強煙草制品的清香，緩和煙氣吸味，掩蓋刺激性。此外，鑒定出的化合物中還含有少量的2，3，4，5，-四甲基吡嗪、石竹素、馬兜鈴烯環(huán)氧化物等。從以上分析可見，滁菊凈油中的多種成分可能具有增強卷煙香氣、降低煙氣刺激性、改善吸味等作用。

表1 滁菊凈油的GC/MS 分析結(jié)果Table 1 GC/MS analysis results of Chrysanthemum morifolium volatile oils

減壓水蒸氣蒸餾、亞臨界萃取和分子蒸餾的得率分別為0.13%、3.37%、0.5%，1#凈油為黃色透明液體，2#凈油為墨綠色粘稠油狀物，3#凈油為黃綠色澄清透明液體，三者均具有濃郁的菊花香氣和藥草香。亞臨界萃取的產(chǎn)率最高，這是因為以丁烷為萃取溶劑時，萃取物中不僅含有易揮發(fā)性物質(zhì)，同時也包含部分大分子物質(zhì)。經(jīng)分子蒸餾之后，在一定的蒸餾溫度及壓力下，不易揮發(fā)、分子平均自由程較小的物質(zhì)集中在重組分中，輕組分中高沸點物質(zhì)的含量大大降低，因而3#凈油的產(chǎn)率也大大降低。減壓水蒸氣蒸餾只提取植物中的低沸點、易揮發(fā)物質(zhì)，提取物中幾乎無非揮發(fā)大分子物質(zhì)，而植物中的揮發(fā)油含量本身較少，因此，1#凈油的產(chǎn)率最低。

制備方法不同，所得凈油中揮發(fā)性物質(zhì)的種類及含量差異較大。如表2 所示，三種凈油鑒定出的揮發(fā)物總量分別為 22.080%、3.1654%、14.1987%。減壓水蒸氣蒸餾的總量最高，而亞臨界萃取的總量最低。這是因為，水蒸氣蒸餾是將植物中的揮發(fā)性成分隨水蒸氣一并餾出，經(jīng)冷凝后收集，半揮發(fā)或難揮發(fā)物質(zhì)的含量極低，而亞臨界萃取物中仍含有大量高沸點物質(zhì)，因此1#凈油中鑒定出的物質(zhì)種類最多，且總量也最多，而2#凈油中鑒定出的物質(zhì)種類及含量最低。3#凈油是在2#的基礎(chǔ)上，采用分子蒸餾，在80 ℃的蒸餾溫度下，對其中的輕組分進行富集，有效降低了高沸點物質(zhì)的含量，因而其含量較2#有明顯提高。

表2 三種凈油中各類化合物的總含量Table 2 The content of different compounds in the volatile oils

圖1 三種凈油中各類成分的含量對比Fig.1 Content comparison of different compounds in the volatile oils

三種凈油中烯烴類、醇類和酮類的含量均較高，此外還含有部分有機酸、烷烴、雜環(huán)化合物等，但制備方法不同各類物質(zhì)的變化規(guī)律略有差別。如圖1所示，2#和3#凈油中各類物質(zhì)的含量從高到低分別為烯烴類、醇類、酮類、其他類、酯類和有機酸類，其變化規(guī)律一致。其原因在于，亞臨界萃取適用于天然產(chǎn)物分離的前階段，即從原料中萃取有效物質(zhì)，而分子蒸餾是將粗產(chǎn)品中的有效成分進行分離提純，本身不能用于前期的提取。本實驗中分子蒸餾所用粗產(chǎn)品即為2#凈油，因此，在物質(zhì)組成上2#與3#差異較小，但是從物質(zhì)含量上來看，3#凈油中揮發(fā)性物質(zhì)的含量大大提高，例如:2-羥基桉樹腦的含量是分離前的13.93 倍;(E)-β-金合歡烯的含量從0.06579%增加到0.71062%，同時也高于1#凈油中的含量(0.48145%);滁菊揮發(fā)油的主要成分龍腦、β-芹子烯也從原來的0.61%增加到2.7%左右;此外，分離純化后，3#凈油中還鑒定出了菊油環(huán)酮、乙酸異龍腦酯和香橙烯環(huán)氧化物，其中，菊油環(huán)酮是菊花中常見的芳香物質(zhì)，已有報道該物質(zhì)存在于安徽產(chǎn)菊花中［12］。1#凈油中醇類物質(zhì)的含量明顯增高，各物質(zhì)的含量從高到低依次為醇類、烯烴類、酮類、有機酸類、酯類和其他類。這是因為，丁烷為弱極性溶劑，根據(jù)相似相溶原理，該溶劑對極性較大的醇類、有機酸類的萃取率相對較低，對極性較弱的烯烴類萃取效率較高;水蒸氣蒸餾是根據(jù)共沸原理，將易揮發(fā)性物質(zhì)與水共沸而帶出，與物質(zhì)的極性無關(guān)，因而1#凈油中醇類、酸類的含量均有增加。由表1 可見，1#凈油中有機酸的含量明顯增高，鑒定出了異丁酸、異戊酸、正己酸、反式-2-甲基-2-丁烯酸等，這些物質(zhì)的沸點較低，極性較大，因而只存在于水蒸氣蒸餾所得凈油中。此外，1#凈油中龍腦的含量高達11.121%，乙酸龍腦酯的含量為0.32293%，使得醇類和酯類的含量顯著增加。

表3 三種凈油在空白煙支上的加香效果Table 3 Evaluating the effect of three volatile oils on reference cigarettes

2.2 三種滁菊凈油的卷煙加香結(jié)果評價

卷煙加香評吸結(jié)果如表3 所示，三種凈油均能較好的提高香氣質(zhì)、增加香氣量，煙氣柔和細膩，但在減輕殘留和刺激性方面作用較小。1#凈油對殘留有明顯改善，這可能與凈油中多為易揮發(fā)香味物質(zhì)，無大分子物質(zhì)有關(guān);2#凈油中除揮發(fā)、半揮發(fā)物質(zhì)外，還有較多的高沸點物質(zhì)，因而口感較差，余味較差;3#凈油通過分子蒸餾之后，大分子物質(zhì)的含量大大降低，因而口感比2#有較大改變。總體而言，滁菊凈油能夠一定程度上提高香氣質(zhì)和香氣量，柔和煙香，掩蓋雜氣，使得煙氣細膩。

3 結(jié)論

采用減壓水蒸氣蒸餾、亞臨界萃取和分子蒸餾三種方法，制備了滁菊凈油，經(jīng)GC/MS 分析共鑒定出79 種化學(xué)成分，主要包括有機酸類8 種、酮類14種、醇類18 種、烯烴類25 種、酯類7 種，以及其他化合物等。以烯烴類和醇類為主，其中含量較多的是龍腦、β-芹子烯、β-倍半水芹烯、(E)-β-金合歡烯、蒿酮、馬兜鈴環(huán)氧化物等，正是這些物質(zhì)的有機結(jié)合，才構(gòu)成了滁菊的特征香氣。三種方法相比，減壓水蒸氣蒸餾能夠更好的提取滁菊中的龍腦、有機酸類和酯類等香味成分;亞臨界萃取對天然植物中的弱極性物質(zhì)有較好的提取效果，對強極性物質(zhì)的提取效果略差;分子蒸餾能夠降低凈油中高沸點物質(zhì)的含量，富集易揮發(fā)和半揮發(fā)物質(zhì)，有效提高烯烴類和醇類的含量。卷煙加香結(jié)果表明，滁菊凈油具有提高香氣質(zhì)，增加香氣量，使得煙氣細膩柔和，掩蓋雜氣等作用，是一種理想的天然煙用香原料。

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