謝 燕，夏日照，仇佳偉，張 亞，廖曉蘭

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，植物病蟲(chóng)害與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病帶菌種子萌發(fā)的影響

謝 燕，夏日照，仇佳偉，張 亞，廖曉蘭

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，植物病蟲(chóng)害與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

采用抑菌圈法測(cè)定莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌的毒力，平皿培養(yǎng)法測(cè)定莧菜活性物對(duì)帶菌西瓜種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌的最小抑菌濃度為5Mg/ML，E C50為146.349 2Mg/ML；無(wú)菌種子、帶菌種子、16.6%乙醇處理的帶菌種子、莧菜活性物處理的帶菌種子的發(fā)芽勢(shì)分別為87.3%、42.7%、48.0%、60.0%，發(fā)芽率分別為93.3%、54.7%、58.7%、90.0%；經(jīng)5Mg/ML的莧菜活性物處理的帶菌西瓜種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為64.7%和90.7%，而經(jīng)80Mg/ML的莧菜活性物處理的帶菌種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為3.3%和4.7%。這表明莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌有較強(qiáng)抑制作用，在低濃度時(shí)既有抑菌效果又可促進(jìn)種子萌發(fā)，極具開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

西瓜細(xì)菌性果斑??；抑菌作用；發(fā)芽率；發(fā)芽勢(shì)

西瓜細(xì)菌性果斑病是我國(guó)一種限制入境的檢疫性病害，其病原菌為嗜酸菌屬西瓜種（Acidovorax citrulli）。高溫高濕環(huán)境下，西瓜細(xì)菌性果斑病菌繁殖迅速，苗期感染會(huì)導(dǎo)致?tīng)€苗，果實(shí)膨大期感染可使西瓜減產(chǎn)20%以上[1]。近年來(lái)，我國(guó)多地相繼爆發(fā)該病，給西瓜種植業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。西瓜細(xì)菌性果斑病是典型的由種子帶菌引起的傳染性病害[2]，其病原菌一般附著在種子表皮上，有時(shí)也侵入種子內(nèi)部，而且存活時(shí)間長(zhǎng)，一般可存活4～5個(gè)月，抗逆性、抗干旱能力和致病力較強(qiáng)[3-4]，可抑制種子萌發(fā)。

為了解決西瓜細(xì)菌性果斑病菌對(duì)種子萌發(fā)的危害，在前期研究的基礎(chǔ)上，考察了莧菜活性物對(duì)西瓜帶菌種子萌發(fā)的影響，以期為莧菜抗菌資源的合理開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)[5]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌種為西瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。供試植物為莧菜，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)瀏陽(yáng)科研基地提供。供試西瓜種子為洞庭一號(hào)，購(gòu)于馬王堆蔬菜市場(chǎng)。供試培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA），配方如下：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂條24.0 g、蒸餾水1 000ML、pH值7.0～7.2。

實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司）、循環(huán)水真空泵SHZ-DII（I上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司）、臺(tái)式恒溫震蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、節(jié)能型智能恒溫槽DC-2006（寧波新芝生物科技股份有限公司）、超聲波清洗器KQ3200DE（昆山市超聲儀器有限公司）、XY-200型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市松青五金廠）、人工氣候箱QHX-400B5H-Ⅲ（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 莧菜活性物的制備 將新鮮莧菜葉洗凈曬干，高速粉碎至60～90目，取20 g莧菜葉干粉，加入400 ML乙酸乙酯，25℃下120 r/Min震蕩24 h，過(guò)濾，收集濾液；重復(fù)提取1次，合并濾液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀物，再用16.6%乙醇溶解定容至100mg/ML，即莧菜活性物母液。

1.2.2 西瓜細(xì)菌性果斑病菌室內(nèi)毒力測(cè)定 將活化24 h的西瓜細(xì)菌性果斑病病菌用無(wú)菌水配制成濃度為3×108cfu/ML的細(xì)菌懸浮液，再將莧菜活性物稀釋配制成80、40、20、10、5、2.5mg/ML的濃度梯度。參考孫長(zhǎng)霞[6]的平板打孔法測(cè)定莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌的室內(nèi)毒力。方法如下：取200 L細(xì)菌懸浮液均勻涂布于NA平板上，然后在平板中央打孔（φ=7 mm），在孔中分別注入不同濃度的莧菜活性物60 L，以農(nóng)用硫酸鏈霉素作對(duì)照，于28℃恒溫培養(yǎng)48 h，每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)結(jié)束用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，并計(jì)算毒力回歸方程和EC50。

1.2.3 低濃度的莧菜活性物對(duì)帶菌西瓜種子萌發(fā)的影響 （1）帶菌種子制備。供試種子經(jīng)45℃干熱消毒72 h。將種子浸入3×108 cfu/ML西瓜細(xì)菌性果斑病菌菌懸液中，于30℃下150 r/Min振蕩培養(yǎng)2 h，讓西瓜細(xì)菌性果斑病菌接種到種子上獲得帶菌種子。同時(shí)用無(wú)菌種子以無(wú)菌水作相同的處理為空白對(duì)照，接種后將種子迅速風(fēng)干[7]。（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。將帶菌種子分成3組，分別加入無(wú)菌水、16.6%的乙醇和濃度為5mg/ML的莧菜活性物，空白對(duì)照為無(wú)菌種子加無(wú)菌水，分別浸泡60Min，每組150粒[8]，每個(gè)處理重復(fù)3次。（3）種子萌發(fā)。在無(wú)菌培養(yǎng)皿中鋪一層無(wú)菌棉，無(wú)菌棉上再鋪一張無(wú)菌濾紙，將浸泡后的種子用清水反復(fù)沖洗3次，稍晾干后置于培養(yǎng)皿中在28℃下光照培養(yǎng)，以種子發(fā)芽露白為標(biāo)準(zhǔn)，分別在第4天和第10天記錄種子萌發(fā)情況。

1.2.4 不同濃度的莧菜活性物對(duì)帶菌西瓜種子萌發(fā)的影響 帶菌種子的獲取同上，將帶菌種子分成5組，分別置于濃度為80、40、20、10、5mg/ML的莧菜活性物溶液中，浸泡60Min后取出種子，用清水沖洗3次；每個(gè)處理重復(fù)3次。種子萌發(fā)處理同上，以種子發(fā)芽露白為標(biāo)準(zhǔn)，分別在第4天和第10天記錄種子萌發(fā)情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法 采用DPS等數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。試驗(yàn)所用公式如下：

抑制率（%）=（處理抑菌帶寬－對(duì)照抑菌帶寬）/（對(duì)照菌落覆蓋圈直徑－孔徑）×100[9]

種子發(fā)芽勢(shì)（%）=4 d內(nèi)正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100

種子發(fā)芽率（%）=10 d內(nèi)正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

2.1.1 最小抑菌濃度測(cè)定 由圖1可知，莧菜活性物濃度越高，其抑菌活性越強(qiáng)，當(dāng)濃度為5mg/ML時(shí)，莧菜活性物的抑菌效果較弱，濃度為2.5mg/ML時(shí)，莧菜活性物對(duì)病原菌無(wú)抑菌效果。由此可知，莧菜活性物有較好抑菌效果，對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌的最小抑菌濃度為5mg/ML。

圖1 莧菜活性物的最小抑菌濃度測(cè)定

2.1.2 EC50測(cè)定 根據(jù)莧菜活性物的最小抑菌濃度，選取80、40、20、10、5、2.5mg/ML的莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，以農(nóng)用硫酸鏈霉素作為藥劑對(duì)照。由表1可知，莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌的EC50為146.349 2mg/ML；農(nóng)用硫酸鏈霉素EC50是2.775 4mg/ML。

2.2 莧菜活性物對(duì)西瓜種子發(fā)芽的影響

2.2.1 低濃度的莧菜活性物對(duì)帶菌西瓜種子發(fā)芽的影響 由表2可知，不同處理對(duì)西瓜種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率有明顯不同的影響。無(wú)菌種子、帶菌種子、16.6%乙醇處理的帶菌種子、莧菜活性物處理的帶菌種子的發(fā)芽勢(shì)分別為87.3%、42.7%、48.0%、60.0%，其發(fā)芽率分別為93.3%、54.7%、58.7%、90.0%。無(wú)菌水處理的帶菌種子與16.6%乙醇處理的帶菌種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)無(wú)顯著差異，說(shuō)明溶劑對(duì)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率影響不大；用莧菜活性物處理過(guò)的帶菌種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與無(wú)菌種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)無(wú)顯著差異，而用莧菜活性物處理過(guò)的帶菌種子與不經(jīng)處理的帶菌種子相比，兩者的發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率存在極顯著的差異，說(shuō)明莧菜活性物可以殺死帶菌種子中的病菌，起到種子消毒的作用，從而提高種子的發(fā)芽率。

表1 莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病的毒力回歸方程

表2 不同處理下西瓜種子發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率的比較

2.2.2 不同濃度莧菜活性物對(duì)帶菌西瓜種子發(fā)芽的影響 從表3中可以看出，不同濃度的莧菜活性物對(duì)西瓜種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率有不同程度的影響。經(jīng)低濃度（5mg/ML）、中低濃度（10mg/ML）、中濃度（20 mg/ML）、中高濃度（40mg/ML）、高濃度（80mg/ML）莧菜活性物處理的帶菌種子發(fā)芽勢(shì)分別為64.7%、51.3%、46.0%、14%、3.3%，發(fā)芽率分別為 90.7%、62.0%、49.3%、17.3%、4.7%，處理間的差異均達(dá)極顯著水平。與低濃度莧菜活性物相比，中濃度活性物和高濃度活性物顯著降低了帶菌西瓜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。由此可知，高濃度莧菜活性物雖然抑菌活性較強(qiáng)，但它對(duì)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率也有抑制作用，不利于種子萌發(fā)；而低濃度的莧菜活性物雖然抑菌活性不那么強(qiáng)，但對(duì)西瓜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)沒(méi)有不良影響。因此，低濃度的莧菜活性物對(duì)西瓜帶菌種子的消毒效果較好，有利于促進(jìn)種子萌發(fā)。

表3 不同濃度的莧菜活性物處理下西瓜種子發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率的比較

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莧菜活性物對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌有較強(qiáng)的抑制作用，且低濃度的莧菜活性物既能殺死種子上的病菌又能促進(jìn)種子萌發(fā)，顯著提高種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，而高濃度莧菜活性物對(duì)種子萌發(fā)有一定的抑制作用，可能是因?yàn)榍{菜活性物成分復(fù)雜，除了抑菌物質(zhì)，還有其他物質(zhì)存在，具體原因有待進(jìn)一步研究。

西瓜細(xì)菌性果斑病是典型的由種子帶菌引起的傳染性病害，防治困難，市面上有很多種子處理劑，且多以化學(xué)藥劑為主，倘若在使用過(guò)程中操作不當(dāng)，將存在較大安全隱患，或者影響種子萌發(fā)[10]?，F(xiàn)在很多植物資源的提取物具有抑菌作用，但是主要以中草藥植物為主。莧菜作為一種可食用蔬菜，目前的開(kāi)發(fā)利用主要體現(xiàn)在其食用價(jià)值、工業(yè)價(jià)值、觀賞價(jià)值、飼用價(jià)值及醫(yī)用價(jià)值上，未見(jiàn)有對(duì)植物病原細(xì)菌抑制作用方面的研究。該研究證實(shí)莧菜活性物對(duì)細(xì)菌性果斑病菌有較好的抑制作用，其抑菌活性成分相對(duì)安全可靠，在一定程度上避免了化學(xué)藥劑不安全、不環(huán)保的缺點(diǎn)，增加了莧菜植物資源的農(nóng)用價(jià)值，極具開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

[1]王曉青，楊 揚(yáng)，趙 朔，等.我國(guó)瓜類細(xì)菌性果斑病發(fā)生現(xiàn)狀和綜合防控策略[J].植物檢疫，2012，26（5）：79-82.

[2] 何 毅，韋志揚(yáng)，李文信，等.藥物浸種處理防治西瓜嫁接苗細(xì)菌性果斑病試驗(yàn)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42（5）：500-504.

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（責(zé)任編輯：成 平）

GerMination Effects of Active Ingredient in Amaranthus Tricolor on Seeds ContaMinated Acidovorax Citrulli

XIEYan，XIA Ri-zhao，QIU Jia-wei，ZHANG Ya，LIAO Xiao-lan
（College of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests,Changsha 410128,PRC）

Inhibition zone measure w as used for allied toxicity measurement of acitive ingredient in Amaranthus tricolor against Acidovorax citrulli,and platiculturewasused formeasure the influenceof acitive ingredienton thegermination of contaminated seeds.The results showed that the MIC and EC50for active substanceson Acidovorax citrullias follows:MIC=5mg/ML and EC50=146.3492mg/mL. The gerMination potential of sterile seeds,contaMinated seeds,contaMinated seeds treated w ith 16.6%ethanol and contaMinated seeds treated w ith active ingredientwere 87.3%,42.7%,48.0%and 60.0%respectively.W ith respect to the gerMination rates they were 93.3%, 54.7%,58.7%and 90.0%respectively.How ever,the gerMination potentialand the gerMination rate of contaMinated seedsw hich treated by 5 mg/ML active ingredientwere 64.7%and 90.7%，w hile those of which treated by 80 mg/ML active ingredientwere 3.3%and 4.7%. Finally,w e can conclude that the active ingredienthave a good effecton the inhibition of Acidovorax citrulli,aswellas they can accelerate gerMination in low concentration.

Acidovorax citrulli;nhibitory effect;gerMination rate;gerMination potential

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.014

S351.1

A

1006-060X（2015）03-0038-03

2015-03-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31070397）

謝 燕（1989-），女，湖南長(zhǎng)沙市人，碩士研究生，主要從事植物病害的生物防治研究。

廖曉蘭