毛 銳，任佐華，劉 翔，倪蘭鳳，周 瑚，戴良英，劉二明

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2．植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

湖南桃江病圃稻瘟病病菌遺傳多樣性的SS R分析

毛 銳1,2，任佐華1,2，劉 翔1,2，倪蘭鳳1,2，周 瑚1,2，戴良英1,2，劉二明1,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2．植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

為了解湖南桃江病圃稻瘟病病菌遺傳多樣性，選用14對(duì)SS R引物，采用SS R標(biāo)記技術(shù)分析了從該病圃中麗江新團(tuán)黑谷（廣譜高感稻瘟病品種）上分離的89個(gè)稻瘟病菌單孢菌株的遺傳多樣性。結(jié)果表明，以相似系數(shù)0.72為界，將89個(gè)菌株劃分成20個(gè)遺傳譜系，其中L06和L07為優(yōu)勢(shì)宗譜，分別含有18和13個(gè)菌株，各占總菌株數(shù)的20.2%和14.6%；有6個(gè)宗譜分別含4～7個(gè)菌株，共占總菌株數(shù)的34.8%，另12個(gè)宗譜分別含菌株1～3個(gè)，共占總菌株數(shù)的30.3%。該病圃中的稻瘟病菌群體復(fù)雜，遺傳多樣性豐富，湖南抗瘟品種選育和品種布局應(yīng)針對(duì)L06和L07優(yōu)勢(shì)宗譜。

病圃；稻瘟病菌；SS R；遺傳多樣性

稻瘟病是由Magnaporthe oryzae引起的一種重要的氣流傳播的災(zāi)害性水稻真菌病害[1]，它嚴(yán)重影響水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，在發(fā)病嚴(yán)重的年份，減產(chǎn)在10%～50%，全球每年因稻瘟病導(dǎo)致水稻減產(chǎn)在11%～30%[2]。選育并種植抗病品種，是公認(rèn)最直接有效的防治措施之一，但由于田間稻瘟病菌群體組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，易變性或因無(wú)毒基因突變導(dǎo)致抗病品種在推廣3～5 a后抗病性喪失[3]，其引發(fā)病害的流行給生產(chǎn)帶來(lái)極大的危害[4]。因此，明確一個(gè)水稻種植區(qū)域的稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)抗瘟水稻育種材料的發(fā)掘及抗瘟品種的利用和布局有重要的實(shí)踐意義。

近年來(lái)，SSR分子標(biāo)記廣泛運(yùn)用于抗稻瘟病遺傳多樣性的研究。譚清群等[5]對(duì)32份抗瘟病地方種質(zhì)資源進(jìn)行SSR遺傳多樣性分析，確立親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與其地理來(lái)源有一定的相關(guān)性。涂敏等[6]用24對(duì)SSR引物對(duì)云南省160個(gè)水稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，證實(shí)云南省水稻品種的群體遺傳多樣性越高，群體對(duì)稻瘟病的抗性水平越高。李小湘等[7]用SSR分子標(biāo)記方法對(duì)湖南不同來(lái)源地方種質(zhì)136份材料進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)了湖南同（近）名地方稻的遺傳差異程度，為同（近）名地方稻種質(zhì)資源的保存，供種以及重點(diǎn)利用種質(zhì)遴選提供理論依據(jù)。前人對(duì)稻瘟病病圃遺傳多樣性的SSR分析主要集中于國(guó)內(nèi)各區(qū)域性之間，而對(duì)湖南桃江地域性稻瘟病病圃系統(tǒng)研究較少，本研究利用SSR分子標(biāo)記方法分析了2013年湖南桃江稻瘟病菌群體遺傳多樣性，旨在揭示該地區(qū)稻瘟病菌遺傳多樣性特征，為以后湖南水稻瘟品種的選育及抗瘟品種的利用提供必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

供試菌株89個(gè)，是于2013年采自湖南桃江病圃感病品種麗江新團(tuán)黑谷（LTH）上采集的葉瘟感病樣本，利用體式顯微鏡單孢分離法獲得89個(gè)單孢菌體。

1.2 菌株培養(yǎng)和DNA提取

將純化后的供試菌株菌絲接種到稻瘟病菌液體培養(yǎng)基中（葡萄糖20 g、酵母浸出液5 g、CaCl20.1 g、 KH2PO40.5 g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、水1000mL），于28℃、180 r/Min搖床上培養(yǎng)4～6 d，收集聚集成球的菌絲體，采用EasyPureGenomic DNA Kit試劑盒提取稻瘟病菌基因組DNA，并使用NanoDrop的Spectrophotometer檢測(cè)DNA濃度，調(diào)整到150 ng/uL，備用。

1.3 SSR引物

14對(duì)引物：KMS02、KMS20、SMS17、A5、D4、D5、G5、FG01、FG02、FG03、MS355、MS363、MS677、C3，引物由上海introgen公司合成（表1）。

1.4 PCR擴(kuò)增體系及電泳

表1 14對(duì)SSR引物

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為25μL，體系中含有正、反引物各1.25μL，11.5ML去離子水，10μL 2× Taq PCRMasterMix，1μL模板DNA。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s。55～57℃（按特定引物設(shè)定）退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min后4℃保存取擴(kuò)增產(chǎn)物5 uL加Loading Buffer進(jìn)行上樣，在2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓110 V，35min，電泳完后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照并記錄。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增結(jié)果，運(yùn)用Quantity One軟件進(jìn)行分析處理，建立SSR的0-1數(shù)據(jù)庫(kù)，將電泳譜帶的有無(wú)轉(zhuǎn)換成二進(jìn)制，有亮帶即為1，無(wú)亮帶即為0。用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的Nei&Li方法進(jìn)行計(jì)算遺傳距離，運(yùn)用最長(zhǎng)距離進(jìn)行宗譜歸類。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的PCR擴(kuò)增

14對(duì)SSR引物對(duì)89個(gè)供試菌株進(jìn)行了有效擴(kuò)增，不同引物擴(kuò)增不同的供試菌株呈現(xiàn)均有不同。KMS02、KMS20、C3、A5、G5、D4、D5、SMS17、FG01、FG02、FG03、MS355、MS363、MS677分別擴(kuò)增出112、128、130、143、147、134、212、154、82、133、79、128、88和72條亮帶，充分體現(xiàn)出89個(gè)稻瘟病菌株的多態(tài)性，復(fù)雜性。代表性擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

2.2 桃江病圃稻瘟病菌群體的遺傳組成

圖1 引物MS363對(duì)部分供試菌株的擴(kuò)增（M為D N A分子量標(biāo)準(zhǔn)；76～103為供試菌株）

89個(gè)供試稻瘟病菌株在0.72的相似系數(shù)下被劃分為20個(gè)遺傳宗譜，其中優(yōu)勢(shì)宗譜是L06和L07，分別含有18和13個(gè)菌株，各占總菌株數(shù)的20.2%和14.6%，有6個(gè)宗譜分別含4～7個(gè)菌株，共占總菌株數(shù)的34.8%。另12個(gè)宗譜分別含菌株1～3個(gè)，共占總菌株數(shù)的30.3%；具體聚類分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 0.72相似系數(shù)下89個(gè)供試菌株的遺傳宗譜

3 小結(jié)與討論

稻瘟病是危害水稻最嚴(yán)重的真菌病害之一，在水稻新品種推廣3～5 a后會(huì)因田間稻瘟病菌種群的小種變異而喪失抗性成為感病品種，因此及時(shí)準(zhǔn)確地了解田間稻瘟病菌群體的變化趨勢(shì)尤為重要[8-10]。

本研究表明2013年湖南桃江稻瘟病圃中的稻瘟病群體結(jié)果相對(duì)復(fù)雜，遺傳多樣性明顯。虞選杰等[11]應(yīng)用13對(duì)引物對(duì)2012年湖南桃江采集分離的100個(gè)稻瘟病菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并依據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果，對(duì)供試稻瘟病菌群體進(jìn)行聚類分析，將100個(gè)稻瘟病菌菌體劃分為24個(gè)遺傳宗譜。而本研究于2013年在湖南桃江采集分離得到的89個(gè)稻瘟病菌菌體被分為20個(gè)遺傳宗譜，其遺傳宗譜未發(fā)生較大的變化，這說(shuō)明該病圃稻瘟病菌群體在一定的時(shí)期內(nèi)相對(duì)較穩(wěn)定。因此，該病圃作為國(guó)家和湖南水稻品種抗稻瘟病鑒定點(diǎn)是合適的。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)，不僅具有共性好，重復(fù)性好，多態(tài)性高，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，而且能準(zhǔn)確建立SSR的0-1數(shù)據(jù)庫(kù)，并計(jì)算出遺傳宗譜。本試驗(yàn)結(jié)合歷年對(duì)湖南稻瘟病遺傳結(jié)構(gòu)的研究，初步揭示了LTH上的稻瘟病菌與湖南各稻區(qū)栽種品種上的稻瘟病菌在遺傳結(jié)構(gòu)上的相似性，且遺傳宗譜更豐富，遺傳多樣性更復(fù)雜，可為全面了解湖南地區(qū)稻瘟病變化趨勢(shì)，以及抗病育種和利用遺傳多樣性控制稻瘟病的危害與流行提供理論依據(jù)。

[1]鄧其明，周 鵬，林 琳，等.水稻稻瘟病抗性基因研究進(jìn)展及其在育種上的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（4）：1489-1492，1508．

[2] 李 亞，劉二明，戴良英，等.湖南稻瘟病菌群體遺傳多樣性與病菌致病型的關(guān)系[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2007，21（3）：304-308.

[3] 王 靜，李彥泉.水稻稻瘟病綜合防治技術(shù)[J].吉林農(nóng)業(yè)，2012，（6）：69．

[4] 穆慧敏，姜 華，王艷麗，等.研究稻瘟病菌群體遺傳多態(tài)性的分子標(biāo)記方法[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2013，27（5）：545-552.

[5] 譚清群，楊學(xué)輝，何海永，等.32份水稻抗稻瘟病材料的SS R遺傳多樣性分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25（2）：479-484.

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[8]李小湘，肖軍治，段永紅，等.湖南同名地方稻資源SS R標(biāo)記及表現(xiàn)型的比較分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014.，15（2）：248-254.

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[10]黃國(guó)慶，郭加沅，肖國(guó)櫻.SS R標(biāo)記在水稻遺傳育種中的應(yīng)用[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，19（4）：20-22.

[11]虞選杰，任佐華，管玲莉，等.湖南桃江病圃麗江新團(tuán)黑谷上稻瘟病菌遺傳多樣性分析[J].雜交水稻，2014，29（3）：70-73.

（責(zé)任編輯：盧紅玲）

Analysis of Genetic Diversity of Magnaporthe oryzae in Rice Blast Nursery in Taojiang of Hunan by SSR Markers

MAORui1,2，REN Zuo-hua1,2，LIU Xiang1,2，NILan-feng1,2，ZHOU Hu1,2，DAILiang-ying1,2，LIU Er-Ming1,2
（1.College of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC;2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests,Changsha 410128,PRC）

To explore the genetic diversity of Magnaporthe oryzae in rice blastnursery in Taojiang,Hunan,89 single spore isolates of Magnaporthe oryzae isolated froMhighly broad spectruMsusceptible blast variety,Lijiangxintuan were analysed by the SSR technology w ith the14 pairsof primers.The results showed that these isolateswere classified into 20 genetic lineages at the0.72 siMilar level,among which L06 and L07,including 18 and 13 isolates,respectively,accounting for 20.2%and 14.6%of the total isolates,were the dominant lineages,while there were 4～7 isolates accounting for 34.8%of the total isolates in the another 6 lineages,and hold 1～3 isolates accounting for 30.3%of the total isolates in the other 12 lineages.Therefore,it suggested that the blast nursery possessed constituent complex of M.oryzae population and rich genetic diversity.Atpresent,breeding of resistantto riceblast for Hunanmay beagainst L06 and L07 lineages.

blastnursery;Magnaporthe oryzae;SSR;genetic diversity

S435.11.41

A

1006-060X（2015）04-0035-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.013

2015-03-20

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)） （201203014）；湖南省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（12JJ4028）

毛 銳（1990-），男，湖南長(zhǎng)沙市人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锱c植物分子互作。

劉二明