梁金環(huán) 楊曉暉 趙利娜 孟晨陽 崔云鵬 劉伯玲

滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州061001

養(yǎng)陰活血方藥對糖尿病大鼠腎臟線粒體氧化應(yīng)激損傷的影響

梁金環(huán) 楊曉暉 趙利娜 孟晨陽 崔云鵬 劉伯玲

滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州061001

目的探討?zhàn)B陰活血方藥對糖尿病大鼠腎臟線粒體氧化應(yīng)激損傷的影響及相關(guān)機(jī)制。方法將SD大鼠分為三組，正常對照組（NC組）、糖尿病對照組（DM組）和養(yǎng)陰活血方藥治療組（NYPBR組），后兩組應(yīng)用鏈脲佐菌素（STZ）制造糖尿病大鼠模型。NYPBR組大鼠給予養(yǎng)陰活血方藥防治。10周末，測定各組大鼠血糖、體重、腎重、血肌酐（SCr）、24 h尿蛋白，檢測腎臟線粒體丙二醛（MDA）含量及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮合酶（NOS）、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性，透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果與NC組比較，DM組大鼠腎臟線粒體MDA[（1.34±0.24）nmol/mg]、GSH-Px[（57.63±4.91）U/mg]及NOS [（0.81±0.07）U/mg]明顯升高（均P＜0.01），Na+-K+-ATP酶[（1.40±0.10）μmol/（mg·h）]、Ca2+-Mg2+-ATP酶[（1.43± 0.10）μmol/（mg·h）]和SDH[（24.33±2.31）U/mg]顯著降低（均P＜0.01），腎功能減退，腎臟組織發(fā)生病理性改變，線粒體出現(xiàn)損傷。養(yǎng)陰活血方藥可顯著改善上述變化，NYPBR組的MDA[（0.81±0.08）nmol/mg]、GSH-Px[（50.55± 5.86）U/mg]及NOS[（0.72±0.07）U/mg]均低于DM組（P＜0.01或P＜0.05），Na+-K+-ATP酶[（1.66±0.18）μmol/（mg·h）]、Ca2+-Mg2+-ATP酶[（1.76±0.20）μmol/（mg·h）]和SDH[（40.92±3.77）U/mg]明顯上升（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論糖尿病大鼠腎臟線粒體存在明顯的氧化應(yīng)激損傷，NYPBR可顯著減輕糖尿病大鼠腎臟線粒體損傷，此作用可能與降低NOS活性，提高SDH、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性有關(guān)。

糖尿病腎病曰線粒體曰氧化應(yīng)激曰養(yǎng)陰活血方藥

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）即糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病特發(fā)性全身微血管病變的腎臟表現(xiàn)，是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，已成為導(dǎo)致慢性腎衰竭的最主要原因。DN的發(fā)病機(jī)制，目前尚不完全清楚，隨著對DN研究的深入，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在DN發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1-2]。線粒體既是生物氧化及能量轉(zhuǎn)換的主要場所，也是產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的主要部位[3]。近年來，線粒體作為氧化應(yīng)激的重要細(xì)胞器而備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立糖尿病大鼠模型，觀察養(yǎng)陰活血方藥（Nourishing Yin and Promoting Bloodflow Recipe，NYPBR）對糖尿病大鼠腎功能、腎臟線粒體形態(tài)與功能及氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）及一氧化氮合酶（NOS）水平的改變，探討NYPBR對糖尿病大鼠腎臟線粒體的影響及可能機(jī)制，為臨床防治DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

血糖檢測儀（強(qiáng)生公司），鏈脲佐菌素（STZ Sigma公司產(chǎn)品），肌酐（SCr）、尿蛋白定量、考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒及MDA、GSH-Px、ATP酶、琥珀酸脫氫酶（SDH）和NOS測試盒均購自南京建成生物工程研究所，線粒體提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，NYPBR由熟地20 g、牡丹皮20 g、山藥15 g、山萸肉10 g等中藥組成，常規(guī)水煎成1000 g/L生藥濃度藥液[4]。

1.2 糖尿病動物模型建立及分組

選擇體重250～300 g、4月齡健康雄性SD大鼠（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證編號：809091），將其分為兩組：正常對照組（NC組，n=8）；造模組：腹腔注射STZ溶液，注射后3 d尾靜脈血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L，且能維持1周以上，確定糖尿病模型。將成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組（DM組，n=10）和NYPBR組（n=10）。NYPBR組按人和動物間體表面積折算的等效劑量灌喂給藥，每只大鼠3mL/d。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均正常飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 樣本采集

造模成功10周結(jié)束，收集各組大鼠24 h尿液，稱重，檢測血糖；股動脈放血，收集血標(biāo)本，分離腎臟并稱重；取小塊腎皮質(zhì)，4%戊二醛固定，以備電鏡觀察；余下腎皮質(zhì)-80℃保存，待提取線粒體。

1.4 實(shí)驗(yàn)檢測

造模72 h及取材前尾靜脈取血，檢測血糖；測定大鼠體重及腎重，計(jì)算腎肥大指數(shù)，腎肥大指數(shù)=腎重/體重。測定24 h尿蛋白、血SCr。差速離心法提取線粒體，考馬斯亮藍(lán)法測定線粒體蛋白質(zhì)濃度，檢測線粒體MDA含量，測定線粒體GSH-Px、NOS、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及SDH的活性。均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩組比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間，糖尿病大鼠多飲、多食、尿量增加、生長緩慢等癥狀明顯。10周病程結(jié)束時(shí)，與NC組比較，DM組血糖明顯高于NC組，體重減輕，腎肥大指數(shù)增大，同時(shí)24 h尿蛋白和SCr均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與DM組比較，NYPBR組血糖降低但無顯著變化（P＞0.05），體重顯著升高，腎肥大指數(shù)降低，24 h尿蛋白定量和SCr均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血糖、體重、腎肥大指數(shù)、24 h尿蛋白及血肌酐的變化比較（±s）

表1 各組大鼠血糖、體重、腎肥大指數(shù)、24 h尿蛋白及血肌酐的變化比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DM組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別只數(shù)血糖（mmol/L）體重（g）腎肥大指數(shù)（mg/g）24 h尿蛋白（mg）血肌酐（μmol/L）NC組DM組NYPBR組8 10 10 5.26±0.58 25.91±1.30**24.55±1.48 545.38±41.57 317.88±31.69*351.75±30.45▲2.92±0.16 5.95±0.58*5.18±0.40▲7.72±0.68 148.73±15.54**80.54±10.45▲▲122.92±12.14 262.08±41.97**195.00±25.01▲▲

表2 各組大鼠腎臟線粒體MDA、GSH-Px與NOS水平比較（±s）

表2 各組大鼠腎臟線粒體MDA、GSH-Px與NOS水平比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DM組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；MDA：丙二醛；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；NOS：一氧化氮合酶

組別只數(shù)MDA（nmol/mg）GSH-Px（U/mg）NOS（U/mg）NC組DM組NYPBR組8 10 10 0.66±0.10 1.34±0.24**0.81±0.08▲▲40.24±2.82 57.63±4.91*50.55±5.86▲0.64±0.06 0.81±0.07*0.72±0.07▲

2.2 各組大鼠腎臟線粒體MDA堯GSH-Px與NOS水平比較

與NC組比較，DM組MDA、GSH-Px與NOS水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與DM組比較，NYPBR組MDA、GSH-Px和NOS水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

2.3各組大鼠腎臟線粒體SDH堯Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較

與NC組比較，DM組SDH、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與DM組比較，NYPBR組SDH、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠腎臟線粒體SDH、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的變化（±s）

表3 各組大鼠腎臟線粒體SDH、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的變化（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DM組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；SDH：琥珀酸脫氫酶

組別只數(shù)SDH（U/mg）Na+-K+-ATP酶[μmol/（mg·h）] Ca2+-Mg2+-ATP酶[μmol/（mg·h）] NC組DM組NYPBR組8 10 10 42.62±3.51 24.33±2.31**40.92±3.77▲▲1.82±0.21 1.40±0.10*1.66±0.18▲1.85±0.20 1.43±0.10*1.76±0.20▲

2.4 腎皮質(zhì)形態(tài)學(xué)變化

NC組未見明顯異常；DM組可見腎小球基底膜均質(zhì)性增厚，系膜基質(zhì)增多，足突融合；腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)水腫，細(xì)胞器數(shù)量減少，排列紊亂，微絨毛輕度減少，線粒體部分嵴、膜排列紊亂，融合或消失；NYPBR組病理變化較DM組明顯減輕（圖1）。

圖1 各組大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)變化

3 討論

隨著糖尿病發(fā)病率的逐年提高，DN已成為導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的主要原因。多種復(fù)雜機(jī)制介導(dǎo)了DN的發(fā)生，如蛋白非酶糖基化、醛糖還原酶的激活、多元醇途徑的增加、PKC激活等，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是重要的共同機(jī)制[3]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞器，其自身的酶、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA等大分子物質(zhì)也成為ROS直接攻擊目標(biāo)，而損傷的線粒體又會激發(fā)ROS的生成，形成惡性循環(huán)，影響線粒體的結(jié)構(gòu)和功能[5]。線粒體氧化損傷可能在DN的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

線粒體被稱為細(xì)胞的“動力加工廠”，生命活動所需ATP 95%來自于線粒體，在細(xì)胞代謝、應(yīng)激等生命活動中發(fā)揮重要作用。線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶存在于線粒體內(nèi)膜，Na+-K+-ATP酶催化Na+與K+的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，Ca2+-Mg2+-ATP酶則將Ca2+從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)內(nèi)，二者共同維系線粒體膜內(nèi)外的離子平衡。Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP活性的變化反映著線粒體結(jié)構(gòu)與功能的改變[6]。SDH是三羧酸循環(huán)中唯一與線粒體內(nèi)膜結(jié)合的酶，又是線粒體氧化呼吸鏈4種蛋白酶復(fù)合體之一，其活性的變化影響著能量代謝，也是反映線粒體功能的重要標(biāo)志酶[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎臟線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和LDH活性均顯著降低。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的下降，會引起線粒體對Ca2+的攝入減少，胞質(zhì)中Na+增加、Mg2+降低，導(dǎo)致線粒體膜內(nèi)外離子分布狀態(tài)失衡及水積聚，破壞線粒體的結(jié)構(gòu)；同時(shí)，胞質(zhì)中Na+增加，Mg2+降低，又會使Na+-Ca2+交換加強(qiáng)，Mg2+的拮抗作用降低，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的持續(xù)升高，進(jìn)而激活一系列蛋白激酶，影響物質(zhì)代謝及細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷和死亡。本實(shí)驗(yàn)通過電鏡觀察到糖尿病大鼠腎臟已出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)水腫，細(xì)胞器數(shù)量減少，線粒體部分嵴、膜排列紊亂、融合或消失等病理現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)表明糖尿病大鼠已發(fā)生線粒體損傷。

線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場所，通過氧化磷酸化生成ATP的同時(shí)，0.2%～2.0%的氧經(jīng)呼吸鏈電子漏途徑產(chǎn)生ROS，成為細(xì)胞ROS最主要來源[3]。ROS主要包括超氧陰離子（）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、過氧亞硝酸基（ONOO-）等。隨著DM的進(jìn)程，高滲狀態(tài)、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）等可增強(qiáng)ROS的產(chǎn)生[8]。本實(shí)驗(yàn)顯示，10周末，糖尿病大鼠腎臟線粒體MDA含量顯著升高，分解過氧化物的GSH-Px活性過度表達(dá)，說明線粒體ROS生成明顯增多，同時(shí)線粒體NOS被過度激活，表明線粒體處于明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)。NOS存在3種同工酶：內(nèi)皮型NOSⅠ、NOSⅡ和NOSⅢ，線粒體NOS位于線粒體內(nèi)膜基質(zhì)。適宜濃度的NO作為信號分子與O2相互作用調(diào)節(jié)線粒體ATP的生成及鈣穩(wěn)態(tài)，而過量的NO則會引發(fā)氧化應(yīng)激損傷[9]。在實(shí)驗(yàn)中，糖尿病大鼠腎臟線粒體NOS活性增加，可導(dǎo)致NO水平升高，過量生成的NO與可迅速反應(yīng)生成ONOO-，對線粒體發(fā)生不可逆的氧化硝基化損傷[10]。在線粒體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)可被ONOO-硝基化，如酶復(fù)合體Ⅰ、酶復(fù)合體Ⅱ、酶復(fù)合體Ⅲ、ATP合酶、cytc、Mn-SOD等[11-12]。ONOO-對線粒體蛋白質(zhì)的硝基化作用，可直接影響線粒體膜電位、氧化磷酸化、Ca2+的穩(wěn)態(tài)等，造成線粒體結(jié)構(gòu)與功能的改變，加重細(xì)胞損傷。

糖尿病腎病屬中醫(yī)“消渴”病之“下消”范疇。實(shí)驗(yàn)根據(jù)本病腎陰虧損終致陰陽兩虛的病理轉(zhuǎn)歸立法處方。方中以熟地滋腎填精，山萸肉固腎益精，山藥滋補(bǔ)脾陰、固攝精微，不使水谷精微下注，三藥并用，效六味地黃丸三陰并補(bǔ)而重在補(bǔ)腎陰之意，且配丹皮等以清泄肝火，溫補(bǔ)腎陽，固精泄?jié)?。諸藥并用，共收陰陽并補(bǔ)、攝精泄?jié)嶂?。中醫(yī)辨證論治，加減靈活，且安全性高、毒副作用小，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中醫(yī)藥在防治糖尿病腎病方面做了有益探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NYPBR能顯著降低糖尿病大鼠腎臟線粒體氧化應(yīng)激水平，提高線粒體SDH、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，改善線粒體功能，延緩和減輕DN的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病大鼠腎臟線粒體氧化應(yīng)激水平與線粒體損傷程度及腎功能紊亂相一致，提示氧化應(yīng)激造成的線粒體損傷可能是造成糖尿病時(shí)腎臟損傷的重要機(jī)制，NYPBR能顯著減輕糖尿病大鼠腎臟線粒體損傷，其保護(hù)機(jī)制可能與其能有效地降低線粒體NOS活性，提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和SDH活性有關(guān)，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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Effect of Nourishing Yin and Promoting Bloodflow Recipe on the oxidative stress injuries in renal mitochondria of diabetic rats

LIANG JinhuanYANG XiaohuiZHAO Li'naMENG ChenyangCUI YunpengLIU Boling
Cangzhou Medical College,Hebei Province,Cangzhou061001,China

Objective To investigate the effect of Nourishing Yin and Promoting Bloodflow Recipe(NYPBR)on the oxidative stress injuries in renal mitochondria of diabetic rats and related mechanism.Methods SD rats were divided into 3 groups:normal control group(NC group),diabetes control group(DM group)and NYPBR group,the latter 2 groups diabetes rat models were created by streptozotocin(STZ).The NYPBR group was treated with NYPBR.At the end of 10 weeks,blood sugar,body weight,kidney weight,serum creatinine(SCr),24-hour urine protein were measured,and content or activity of renal mitochondria MDA and glutathion peroxidase(GSH-Px),nitric oxide synthase(NOS),ATPase and succinate dehydrogenase(SDH)were determined for each of the 3 groups,and ultrastructure of renal tissue was observed with transmission electron microscope.Results Compared with NC group,renal mitochondria MDA[(1.34± 0.24)nmol/mg],GSH-Px[(57.63±4.91)U/mg]and NOS[(0.81±0.07)U/mg]of DM group were elevated significantly(all P＜0.01),the activities of Na+-K+-ATPase[(1.40±0.10)μmol/(mg·h)],Ca2+-Mg2+-ATPase[(1.43±0.10)μmol/(mg·h)] and SDH[(24.33±2.31)U/mg]decreased greatly(all P＜0.01),and there were renal pathological changes and mitochondria injury.NYPBR could improve the changes.Compared with DM group,renal mitochondria MDA[(0.81± 0.08)nmol/mg],GSH-Px(50.55±5.86)U/mg]and NOS[(0.72±0.07)U/mg]of NYPBR group were decreased significantly (P＜0.01 or P＜0.05)，Na+-K+-ATPase[(1.66±0.18)μmol/(mg·h)],Ca2+-Mg2+-ATPase[(1.76±0.20)μmol/(mg·h)]and SDH[(40.92±3.77)U/mg]elevated greatly(P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion Oxidative stress injuries occur in diabetes rat mitochondria.NYPBR may significantly decrease the injuries of diabetes rat renal mitochondria,which may be related to decreasing in NOS activity,and increasing in SDH,Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase.

Diabetic nephropathies;Mitochondria;Oxidative stress;Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe

R587；R692.3

A

1673-7210（2015）06（b）-0024-04

2015-02-22本文編輯：張瑜杰）

河北省滄州市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（07ZD39）。