張風(fēng)華 李小燕 王寶枝 張曉英

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科，廣東廣州511447；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州511447

耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌分子流行病學(xué)研究

張風(fēng)華1李小燕2▲王寶枝1張曉英1

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科，廣東廣州511447；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州511447

目的探討院內(nèi)普通外科分離的銅綠假單胞菌的基因同源性及Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TTSS）的毒力基因的臨床意義。方法采用紙片擴(kuò)散法（KB法）及微量肉湯稀釋法檢測2009年12月～2014年9月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普通外科臨床分離的102株銅綠假單胞菌對常用的13種抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。采用脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術(shù)對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌進(jìn)行基因分型及毒力基因篩查，同時采用PCR調(diào)查毒力基因exo U、exo S在耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌中的發(fā)生率。結(jié)果102株銅綠假單胞菌對臨床常用的13種抗菌藥物耐藥率均低于30%，對阿米卡星的耐藥率最低（9.8%），對亞胺培南的耐藥率為23.5%，對美羅培南的耐藥率為18.6%。24株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌PCR檢測顯示均攜帶TTSS，其中3株exo U+/exo S-，21株exo U-/exo S+；PFGE分型主要為A、B、C、D、E、F共6型，其中A型為主要流行株。回顧性分析表明，exo U+/exo S-型患者臨床特征是多有氣管插管史、ICU住院史、抗感染治療多采用聯(lián)合用藥，以銅綠假單胞菌感染居多；exo U-/exo S+患者的臨床特征是多存在肺部基礎(chǔ)疾病，預(yù)后好于exo U+/exo S-型患者，以銅綠假單胞菌定植居多。結(jié)論耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌在普通外科存在流行趨勢，應(yīng)加強(qiáng)銅綠假單胞菌耐藥監(jiān)測，防止耐藥菌的暴發(fā)流行。

銅綠假單胞菌；耐碳青霉烯；脈沖場凝膠電泳

銅綠假單胞菌是臨床常見的非發(fā)酵條件致病菌之一，在院內(nèi)容易引起傳播，尤其在設(shè)備及器械上均可分離到本菌，可通過各種途徑傳播給患者。碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是治療銅綠假單胞菌最有效的藥物之一[1]。但是隨著該類藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對其耐藥性也逐漸上升[2]，嚴(yán)重影響其臨床應(yīng)用。近幾年來，世界各地均已發(fā)現(xiàn)多重耐藥銅綠假單胞菌，并報道了有相關(guān)的暴發(fā)和流行趨勢，發(fā)現(xiàn)其耐藥率正逐年上升[3]。判斷耐藥細(xì)菌的同源性，可以對其進(jìn)行分子分型分析判斷是否存在有克隆播散，而分子分型對于控制院內(nèi)感染播散以及指導(dǎo)臨床用藥治療具有非常重要的作用和意義。為了解院內(nèi)普通外科銅綠假單胞菌的基因同源性并且探討銅綠假單胞菌在普通外科是否存在流行趨勢，本研究收集102株銅綠假單胞菌臨床分離株，采用13種臨床上經(jīng)常使用的抗生素進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)，同時還采用脈沖場凝膠電泳（puised—fieid geiele etrophoresis，PFGE）對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌臨床分離株進(jìn)行基因分型。此外，有研究表明，Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TTSS）是銅綠假單胞菌重要的致病機(jī)制[3]，TTSS陽性銅綠假單胞菌常以exo U+/exo S-、exo U-/exo S+、exo U+/exo S+、exo U-/exo S-4種形式存在。因此，本研究還對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌臨床分離株進(jìn)行調(diào)查，比較exo U、exo S基因陽性菌株的分子流行病學(xué)特征和治療轉(zhuǎn)歸，以期為下一步開發(fā)針對銅綠假單胞菌致病毒素的非抗菌藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源收集2009年12月～2014年9月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院（以下簡稱“我院”）普通外科臨床分離銅綠假單胞菌共102株，所有菌株均經(jīng)鑒定證實(shí)，采用法國生物梅里埃公司所生產(chǎn)的VITEK2 Compact全自動微生物鑒定分析系統(tǒng)為鑒定系統(tǒng)。采用的質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2 主要試劑中國藥檢所生產(chǎn)的哌拉西林、氨曲南、阿米卡星、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢噻肟和他唑巴坦等抗生素粉針劑；華山抗生素研究所提供的參考菌株沙門菌Braenderup血清型H9812。大連TaKaRa公司所生產(chǎn)的SpeI限制性內(nèi)切酶和蛋白酶K；PFGE使用膠為美國美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的Gold Agarose瓊脂糖膠。

1.1.3 主要儀器法國生物梅里埃股份有限公司生產(chǎn)的VITEK2 Compact全自動微生物鑒定分析系統(tǒng)；美國Bio-RAD公司生產(chǎn)的紫外線投射凝膠成像系統(tǒng)和Bio-RAD CHEF MapperTM脈沖場凝膠電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 采用微量肉湯稀釋法檢測抗生素的藥物敏感性試驗(yàn)按照2013年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）公布的標(biāo)準(zhǔn)，102株銅綠假單胞菌對13種抗生素的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）根據(jù)上述的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測[4]。

1.2.2 PFGE肉湯搖菌培養(yǎng)過夜，取1 mL菌液離心后用雙蒸水混勻并加入低熔點(diǎn)瓊脂膠進(jìn)行包埋，在含有20 μL蛋白酶K的細(xì)胞裂解液中54℃水浴搖床2 h。切膠后用限制性內(nèi)切酶SpeI 37℃酶切4 h。加熱溶解l%Gold Agarose瓊脂糖膠后冷卻至55℃（瓊脂糖膠由0.5×TBE緩沖液配制而成），倒入模具后靜置30 min成型。電泳條件設(shè)置：脈沖時間6.75～35.38 s，6 V/cm，相對分子質(zhì)量30 000～600 000，14℃，電場角度120°，總時間為20 h。結(jié)果觀察：電泳結(jié)束后用0.25 mg/L的溴化乙錠（EB）染色30 min，后蒸餾水沖洗15 min，在凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）采用全球統(tǒng)一參考菌株沙門菌Braenderup血清型H9812。PFGE按美國疾病控制和預(yù)防中心（Centers for Disease Contrl and Prevention，CDC）推薦的方法判讀結(jié)果，差異3個條帶以上者為另一型，酶切后圖譜完全一致定為同一型，有1～3個條帶不同者為同一型的不同亞型。

1.2.3 PCR檢測TTSS系統(tǒng)參照文獻(xiàn)[5-7]，設(shè)計(jì)PCR引物（表1），采用25 μL的PCR反應(yīng)體系，其中包含了2倍PCR混合溶液（含有脫氧和磷酸PCR緩沖體系，廣州東盛生物科技公司生產(chǎn)）12.5 μL、H2O為9.5 μL、P1引物為1 μL、P2引物為1 μL、DNA模板1 μL。設(shè)定的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min，然后94℃30 s、62℃30 s、72℃60 s，循環(huán)35次，最后在72℃時延伸7 min。所擴(kuò)增得產(chǎn)物經(jīng)l0 g/L瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠（0.5 μg/mL）染色15 min后，在實(shí)驗(yàn)室的成像儀下密切觀察并攝像記錄其詳細(xì)的結(jié)果。所得到的PCR產(chǎn)物由深圳東盛生物科技公司完成測序，將所得到的序列檢測結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中彩用BLAST程序進(jìn)行相關(guān)分析，進(jìn)行菌株的毒力基因類型的判定。

表1 銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)以及檢測引物

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果分析

普通外科收集的102株銅綠假單胞菌對13種抗生素普遍耐藥，對阿米卡星的耐藥率最低（9.8%），其次是對妥布霉素的耐藥率（10.8%）；對氨曲南和亞胺培南的耐藥率最高，分別為24.5%和23.5%。在耐碳青霉烯類組，24株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌，除了對亞胺培南和美羅培南的耐藥率最高之外，對頭孢哌酮/舒巴坦、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均高于50%。見表2。

表2 銅綠假單胞和耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌對抗菌藥物的敏感率、耐藥率（%）

2.2 基因同源性分析

對24株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌經(jīng)SpeI限制性內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行脈沖場凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，圖像應(yīng)用PFGE分析軟件Bionumerics 6.0處理分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6個克隆株。其中A型（包括亞型Al、A2）16株，B型2株，C型2株，D型2株，E型1株，F(xiàn)型1株。見圖1。

圖1 PFGE軟件分析

2.3 PCR檢測TTSS系統(tǒng)結(jié)果

24株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌PCR檢測顯示均攜帶TTSS，其中3株exo U+/exo S-，21株exo U-/exo S+?；仡櫺苑治霰砻?，exo U+/exo S-型患者臨床特征是多有氣管插管史、ICU住院史、抗感染治療多采用聯(lián)合用藥，以銅綠假單胞菌感染居多；exo U-/exo S+的臨床特征是多存在肺部基礎(chǔ)疾病，預(yù)后好于前者，以銅綠假單胞菌定植居多。

3 討論

銅綠假單胞菌是條件致病菌中的一種，一般為醫(yī)院內(nèi)獲得性感染，很容易導(dǎo)致醫(yī)院感染的暴發(fā)和流行。近年來，世界各地都收集到對碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌，并且暴發(fā)流行[8]。

在TTSS毒力蛋白組中，ExoS和ExoU的臨床意義尤為重要。exo U+表達(dá)蛋白ExoU可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和壞死，因此稱其為細(xì)胞毒型基因，其所造成的危害是非常大的；exo S+表達(dá)蛋白ExoS被稱為細(xì)胞侵襲型基因，能抑制細(xì)胞的分裂并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡等，這可能與其具有腺苷二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)[9]。exoU+銅綠假單胞菌感染后的癥狀與exo S+比較更為嚴(yán)重，所致患者的病死率更高[10]。隨著exo S、exoU毒力基因的產(chǎn)生，給臨床抗菌治療帶來極大困難。

銅綠假單胞菌常以exo U-/exo S+（侵襲型）和exo U+/exo S-（細(xì)胞毒型）形式存在。既往研究顯示，TTSS和患者較差的臨床預(yù)后密切相關(guān)，而對于攜帶不同類型TTSS菌株患者的臨床特征鮮有報道[11-13]。本次研究中，結(jié)合了患者臨床特征以及exo U和exo S毒力表型的分析，為區(qū)分我院普通外科住院患者中銅綠假單胞菌定植或是感染提供了可靠依據(jù)：檢測到exo U基因?yàn)殛栃缘幕颊?，其銅綠假單胞茵的毒力強(qiáng)，容易導(dǎo)致全身感染，并且患者的病死率較其它的高，故臨床上應(yīng)積極地早期選擇有效的抗生素進(jìn)行治療；檢測到exo S基因?yàn)殛栃缘?，因?yàn)殂~綠假單胞菌有定植于患者皮膚以及呼吸道的傾向，應(yīng)密切觀察病情變化、根據(jù)病情變化調(diào)整抗生素的使用，避免抗生素使用過度[14-16]。

PFGE技術(shù)具有非常好的重復(fù)性和分辨率，是研究細(xì)菌基因分型中的“金標(biāo)準(zhǔn)”[17]，因此運(yùn)用此方法對24株多重耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行同源性分析，比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多來源于同一個克隆株，而該24株菌均分離于不同患者的不同標(biāo)本，其中有16株屬于同一菌株（主流型），時間跨度2011～2014年，提示患者之間存在交叉感染；同時，同一克隆型細(xì)菌之間，耐藥性有差異，這可能與不同患者使用不同抗菌藥物有關(guān)。因此，醫(yī)院存在耐藥克隆株的傳播流行時，應(yīng)該采取有效措施控制銅綠假單胞菌的傳播；密切監(jiān)測耐藥株的變遷和發(fā)展趨勢，是防止和延緩銅綠假單胞菌耐藥和暴發(fā)流行的必要措施。

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Study of the resistance mechanisms to carbapenems and molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa

ZHANG Fenghua1LI Xiaoyan2▲WANG Baozhi1ZHANG Xiaoying1
1.Department of General Surgery,the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province, Guangzhou511447,China;2.Department of Clinical Lab,the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou511447,China

Objective To investigate the general surgery of Pseudomonas aeruginosa nosocomial gene homology and typeⅢsecretion system(TTSS)virulence genes of clinical significance.Methods 102 strains of pseudomonas aeruginosa isolated from December 2009 to September 2014 in Department of General Surgery,the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,the minimal inhibitory concentration of those Pseudomonas aeruginosa to 13 kinds of commonly used antibiotics were detected by the method of disc diffusion and trace the broth dilution.Genotyping and virulence gene screening of Penicillium carbon alkene resistant Pseudomonas aeruginosa were carried by pulsed field gel electrophoresis(PFGE)technology,at the same time incidence rate of virulence genes exo U and exo S in carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa was investigated by PCR.Results 102 strains of Pseudomonas aeruginosa to clinical commonly used 13 kinds of antimicrobial resistance were less than 30%,the lowest prevalence of Amikacin resistance(9.8%),resistant rate to Imipenem were 23.5%,resistant rate to Meropenem were 18.6%.24 strains Penicillium resistant to carbon alkene detect Pseudomonas aeruginosa PCR showed all carry TTSS,three strains exo U+/exo S-,21 strains exo U-/exo S+;types of PFGE were A,B,C,D,E,F,a total of 6 types,and type A was the main epidemic strains.Retrospective analysis showed that,clinical characteristics of patients with exo U+/exo S-type was more histories of endotracheal intubation and ICU admission,anti-infection treatment with combination,in the majority with Pseudomonas aeruginosa infection.clinical features of patients with exo U-/exo S+was many patients existed pulmonary diseases,the prognosis of patients with exo U-/exo S+was better than that of patients with exo U+/exo S-,in the majority with Pseudomonas aeruginosa engraftment.Conclusion Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in general surgery are popular trend,Pseudomonas aeruginosa resistance monitoring should be strengthened,to prevent the epidemic of drug-resistant bacteria.

Pseudomonas aeruginosa;Resistance to carbapenems;Pulsed field gel electrophoresis

R632

A

1673-7210（2015）06（b）-0101-04

2015-01-26本文編輯：任念）

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項(xiàng)課題項(xiàng)目（B2014200）；廣東省廣州市教育局青年項(xiàng)目（10A271）。

張風(fēng)華（1975.11-），男，碩士研究生；研究方向：肝膽胰脾外科。

▲通訊作者