牟 燕，周開誼，徐 丹，于瑞婷，李 京，岳 陽，周立剛

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193

植物內(nèi)生真菌(Plant endophytic fungi)是生活史中的某一或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)部，并不引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的真菌［1］。內(nèi)生真菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類型多樣的代謝產(chǎn)物，具有抗菌、殺蟲、抗病毒、細(xì)胞毒、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)植物生長等多種生物活性，其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用前景［2，3］。螺二萘類化合物(Spirobisnaphthalenes)是一類含有雙環(huán)二氧代萘結(jié)構(gòu)的真菌代謝產(chǎn)物，具有多種生物活性［4］。我們研究小組前期從藥用植物盾葉薯蕷(Dioscorea zingiberensis)根狀莖中分離到一株能產(chǎn)生螺二萘類化合物的內(nèi)生真菌Berkleasmium sp.Dzf12［5，6］，其中Palmarumycins C12和C13是內(nèi)生真菌Berkleasmium sp.Dzf12 中兩個(gè)主要的螺二萘類化合物，并能分泌到胞外［7，8］。Palmarumycins C12和C13具有抗菌、殺藻、細(xì)胞毒、抑制磷脂酶D 等多種生物活性［4，9］。為了加速Palmarumycins C12和C13的開發(fā)與應(yīng)用，有必要提高內(nèi)生真菌Berkleasmium sp.Dzf12 中Palmarumycins C12和C13的含量和產(chǎn)量?？刹捎酶淖儩B透壓、變溫處理、添加前體物質(zhì)、優(yōu)化培養(yǎng)基條件、兩相培養(yǎng)(如添加大孔吸附樹脂)、多糖和寡糖誘導(dǎo)子、金屬離子，以及共培養(yǎng)等多種物理、化學(xué)和生物等方法來提高真菌代謝產(chǎn)物的含量和產(chǎn)量［10-13］。對于分泌到胞外的代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵液中添加大孔樹脂吸附代謝產(chǎn)物，可以減少產(chǎn)物對真菌代謝的抑制、有利于產(chǎn)物的提取和制備、防止產(chǎn)物的降解、便于連續(xù)培養(yǎng)和降低生產(chǎn)成本等，從而有效促進(jìn)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，這方面已有許多成功的報(bào)道［14-17］。本研究采用3 種大孔吸附樹脂(D3520、DS-8 和DM-301)分別添加到培養(yǎng)液中，研究其添加量和收獲時(shí)間對Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量積累的影響，為將來培養(yǎng)內(nèi)生真菌Berkleasmium sp.Dzf12 大規(guī)模生產(chǎn)Palmarumycins C12和C13提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

內(nèi)生真菌Berkleasmium sp.Dzf12(GenBank 登錄號:EU543255)由本研究小組從盾葉薯蕷(Dioscorea zingiberensis)根狀莖中分離得到，于4 ℃下保存在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂(PDA)平板上［5］。從PDA 試管斜面上挑取少許內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲到PDA 平板上活化15～20 d，然后挑取活化的菌絲接種于三角瓶中，每300 mL 體積的三角瓶裝PDB 培養(yǎng)基100 mL，在25 ℃、150 rpm 條件下懸浮培養(yǎng)3～4 d 后得到內(nèi)生真菌Dzf12 種子培養(yǎng)液。將制備好的種子培養(yǎng)液(3mL)接種到裝有30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，體積為125 mL 的三角瓶中，在25 ℃、150 rpm 條件下懸浮培養(yǎng)13 d 后收獲。培養(yǎng)基組成為:葡萄糖(40 g/L)、蛋白胨(10 g/L)、KH2PO4(1.0 g/L)、MgSO4·7H2O(0.5 g/L)、FeSO4·7H2O(0.05 g/L)，培養(yǎng)基初始pH 值調(diào)節(jié)至為6.5。

1.2 儀器與試劑

AL-104 型電子分析天平(Mettler Toledo 儀器上海有限公司);FLC-3 型超凈工作臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);LS-B55L 型立式壓力蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療儀器廠)、DRP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、DELTA-320 型pH 計(jì)(Mettler Toledo 儀器上海有限公司)、RE50 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、TTL-30C 型超純水器(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)、LC-20AT 高效液相色譜儀分析系統(tǒng)(日本島津公司)等。

大孔吸附樹脂D3520、DS-8 和DM301 購自天津海光化工有限公司，其物理和化學(xué)特性如表1。大孔樹脂使用前用甲醇浸泡，超聲處理30 min，然后過濾除去甲醇，用蒸餾水清洗三次，過濾后稱量濕重(W1)，65 ℃烘干至恒重(W2)，水分含量(%)=100×(W1-W2)/W1。二氯甲烷，甲醇等試劑均為色譜純或分析純。

表1 供試大孔吸附樹脂的物理化學(xué)特性Table 1 Chemical and physical properties of the tested macroporous resins

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理及添加

將3 種大孔吸附樹脂用無水乙醇在室溫下浸泡24 h，用蒸餾水洗3～5 次，至洗出液不顯渾濁為止。然后用1 mol/L NaOH 溶液浸泡12 h，蒸餾水洗至中性，再用1 mol/L HCl 溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性［18，19］。分別稱取已處理好的大孔吸附樹脂0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 g 包裝在一層尼龍膜中，浸泡在超純水中于121 ℃滅菌20 min，用濾紙吸去表面水分，于第9 d 分別添加至培養(yǎng)瓶(內(nèi)裝30 mL 培養(yǎng)液)中，樹脂添加濃度分別為:1.67%、2.50%、3.33%、4.17%、5.00%、5.83%和6.67%(g/mL)。培養(yǎng)0、16、32、48、64、80、96、112、128、144 h 后分別收獲。對照為不添加大孔吸附樹脂，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.2 菌絲生物量的測定

大孔吸附樹脂與內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲共培養(yǎng)至收獲期后，采用減壓抽濾的方法將菌絲和菌液分開，菌絲用蒸餾水沖洗三次。然后將菌絲置于50～55℃的烘箱中烘干至恒重，稱量得到菌絲的干重。

1.3.3 螺二萘類化合物的提取

菌絲中螺二萘類化合物的提取:將烘干至恒重的菌絲研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取50.0 mg 置于15 mL的玻璃試管中，向其加入氯仿-甲醇(1∶9，v/v)提取液，超聲浸提3 次，每次60 min，合并提取液。過濾，濾液減壓濃縮后，向其加入1 mL 色譜純甲醇，使其充分溶解，用孔徑為0.22 μm 的濾膜過濾，用于HPLC 分析。

菌液中螺二萘類化合物的提取:取3 mL 菌液，減壓濃縮至干，向其加入氯仿-甲醇(1∶9，v/v)提取液，超聲浸提3 次，每次60 min，合并提取液。其它步驟同上。

大孔吸附樹脂中螺二萘類化合物的提取:用甲醇浸提大孔吸附樹脂，共3 次，合并提取液。過濾，將濾液減壓濃縮至干，向其加入30 mL 色譜純甲醇，使其充分溶解，用孔徑為0.22 μm 的濾膜過濾，用于HPLC 分析。

1.3.4 Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量的定量分析

螺二萘類化合物Palmarumycins C12和C13標(biāo)準(zhǔn)品由本實(shí)驗(yàn)室提供［7］。采用HPLC 方法分析樣品中Palmarumycins C12和C13的產(chǎn)量［13］，分析條件為:Ultimate TM XB C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Welch Materials，Inc.，Ellicott，MD，USA);流動相為甲醇-水(50∶50，v/v)，流速為1 mL/min，檢測時(shí)間20 min，柱溫40 ℃;SPD-M20A 二極管陣列檢測器，檢測波長226 nm，樣品進(jìn)樣量為10 μL，Palmarumycins C12和C13的保留時(shí)間分別為14.33 min 和9.49 min。菌絲提取物的HPLC 圖譜見圖1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品，分別建立峰面積(Y)與目標(biāo)產(chǎn)物濃度(X)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得Palmarumycin C12的線性回歸方程:Y=121295.5 X+175236.8(R=0.9997);Palmarumycin C13的線性回歸方程:Y=121362.5 X+256167.5(R=0.9997)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有的處理均設(shè)置三個(gè)重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并通過SAS version 8.2 軟件進(jìn)行顯著性差異分析，當(dāng)P≤0.05 時(shí)，表明各處理間差異達(dá)到顯著水平。

圖1 菌絲提取物的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of the mycelia extract

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長、Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量的影響

在培養(yǎng)第9 d，分別添加濃度為5.00%(g/mL)的大孔吸附樹脂于內(nèi)生真菌Dzf12 發(fā)酵液中，共培養(yǎng)96 h 后，檢測3 種大孔吸附樹脂對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長、Palmarumycins C12和C13分別在菌絲、菌液和樹脂中產(chǎn)量積累的影響。結(jié)果(見表2)表明，除大孔吸附樹脂DS-8 外，D3520 和DM-301對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長的影響不顯著。3 種大孔吸附樹脂均能夠有效吸附螺二萘類化合物Palmarumycins C12和C13。3 種樹脂能顯著促進(jìn)Palmarumycin C12產(chǎn)量的提高，且81.3%～95.8%的Palmarumycin C12被大孔樹脂吸附，樹脂DM-301 能夠促使Palmarumycin C12的產(chǎn)量達(dá)到109.02 mg/L，為對照(2.00 mg/L)的54.51 倍。只有樹脂DM-301 能夠促進(jìn)Palmarumycin C13的產(chǎn)量提高，樹脂DS-8 和D3520 對Palmarumycin C13產(chǎn)量的積累表現(xiàn)出抑制作用。

綜合考慮3 種大孔吸附樹脂的吸附性能和對兩種目標(biāo)化合物(Palmarumycins C12和C13)積累的影響，樹脂DM-301 表現(xiàn)出最好的促進(jìn)效果，并用于后續(xù)的樹脂添加量和共培養(yǎng)收獲時(shí)間的研究。

2.2 樹脂DM-301 添加量對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長、Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量的影響

樹脂DM-301 分別以濃度為1.67%、2.50%、3.33%、4.17%、5.00%、5.83%和6.67%于第9 d添加至內(nèi)生真菌Dzf12 發(fā)酵液中，共培養(yǎng)96 h 后，檢測大孔吸附樹脂DM-301 不同添加量對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長、Palmarumycins C12和C13積累的影響，其結(jié)果見圖2。樹脂DM-301 不同添加量對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長沒有顯著影響(圖2A)。根據(jù)圖2B，樹脂DM-301 促進(jìn)Palmarumycin C12大量分泌到胞外，便被樹脂DM-301 吸附，其菌液中Palmarumycin C12的產(chǎn)量與對照相比顯著降低。當(dāng)添加樹脂DM-301 濃度為4.17%時(shí)，Palmarumycin C12總產(chǎn)量達(dá)到最大值(116.53 mg/L)，為對照(2.13 mg/L)的54.71 倍;Palmarumycin C13總產(chǎn)量也同樣達(dá)到最大(52.84 mg/L)，為對照(29.86 mg/L)的1.77 倍(圖2C)。由此確定樹脂DM-301 的最佳添加濃度為4.17%。

表2 大孔吸附樹脂對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長和Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of macroporous resins on mycelia growth，palmarumycins C12and C13yield in liquid culture of Berkleasmium sp.Dzf12

圖2 樹脂DM-301 添加量對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長(A)、Palmarumycins C12(B)和C13(C)產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of resin DM-301 on mycelia growth(A)，palmarumycins C12(B)and C13(C)yield in liquid culture of Berkleasmium sp.Dzf12

2.3 樹脂DM-301 收獲時(shí)間對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長、Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量的影響

將無菌處理的大孔吸附樹脂DM-301 添加至內(nèi)生真菌Dzf12 發(fā)酵培養(yǎng)液中，研究收獲時(shí)間(即共培養(yǎng)時(shí)間)對菌絲生長、Palmarumycins C12和C13總產(chǎn)量積累的影響，結(jié)果如圖3 所示。菌絲生長量隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長并沒有出現(xiàn)顯著變化。而Palmarumycins C12和C13的總產(chǎn)量隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，然后逐漸平穩(wěn)。當(dāng)樹脂DM-301 于第9 d 添加，添加量為4.17%(g/mL)，共培養(yǎng)112 h 后，Palmarumycins C12和C13的產(chǎn)量(122.72 mg/L 和55.99 mg/L)均達(dá)到最大值，分別為對照(2.19 mg/L 和29.86 mg/L)的56.04 倍和1.88 倍。由此確定添加樹脂DM-301 后最佳收獲時(shí)間為共培養(yǎng)112 h。

3 結(jié)論

圖3 添加樹脂DM-301 后收獲時(shí)間對內(nèi)生真菌Dzf12 菌絲生長和Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of incubation time of resin DM-301 on mycelia growth，palmarumycins C12and C13yield in liquid culture of Berkleasmium sp.Dzf12

本研究比較了3 種大孔吸附樹脂(D3520、DS-8和DM-301)對內(nèi)生真菌Berkleasmium sp.Dzf12 菌絲生長、螺二萘類化合物Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量積累的影響。3 種樹脂均顯著促進(jìn)Palmarumycin C12產(chǎn)量的提高，且81.3%～95.8%的Palmarumycin C12被大孔樹脂吸附。只有樹脂DM-301 同時(shí)有利于兩種螺二萘類化合物Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量的提高。當(dāng)樹脂DM-301 以濃度4.17%(g/mL)于第9 d 添加、共培養(yǎng)112 h 后，Palmarumycins C12和C13的產(chǎn)量分別達(dá)到122.72 mg/L 和55.99 mg/L，分別為對照(2.19 mg/L 和29.86 mg/L)的56.04 倍和1.88 倍。添加樹脂DM-301 對Palmarumycin C13積累有一定的促進(jìn)作用，但遠(yuǎn)不如對Palmarumyicn C12積累的促進(jìn)作用，樹脂D3520 和DS-8 對Palmarumycin C13的積累還有一定的抑制作用(表1)，由于Palmarumycin C12是Palmarumycin C13的生物合成的直接前體［20，21］，添加大孔樹脂后，造成了Palmarumycin C12大量分泌到胞外，從而使Palmarumycin C13產(chǎn)量減少，這一現(xiàn)象尚需進(jìn)一步研究。在真菌發(fā)酵培養(yǎng)中，代謝產(chǎn)物常常能分泌到胞外，典型的例子有內(nèi)生真菌芬芳鐮刀菌(Fusarium redolens)Dzf2 發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)白僵菌素(Beauvericin)［15］，靈芝(Ganoderma lucidum)發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)靈芝酸(Ganoderic acids)［22］。本研究涉及的內(nèi)生真菌Berkleasmium sp.Dzf12 代謝產(chǎn)物Palmarumycins C12和C13能分泌到胞外，為添加大孔吸附樹脂吸附胞外的代謝產(chǎn)物，降低胞外產(chǎn)物濃度，減少產(chǎn)物抑制創(chuàng)造了條件，最終有效提高Palmarumycins C12和C13的產(chǎn)量。

不同大孔吸附樹脂對內(nèi)生真菌Dzf12 中Palmarumycins C12和C13產(chǎn)量積累的影響存在顯著差異，可能與大孔吸附樹脂的極性、表面積、孔徑大小、螺二萘類化合物極性等因素相關(guān)。本研究所篩選的大孔樹脂種類有限，有必要擴(kuò)大樹脂的類型，篩選到更為合適的樹脂。另外，所篩選的大孔吸附樹脂(如樹脂DM-301)對螺二萘類化合物的吸附和解吸附動力學(xué)有待進(jìn)一步研究。本論文結(jié)果為今后大規(guī)模培養(yǎng)內(nèi)生真菌Berkleasmium sp.Dzf12 生產(chǎn)Palmarumycins C12和C13提供了依據(jù)。

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