劉 琴，宋 珅，郭 杰，羅 順，張 繼，2*

1 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2 甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心;3甘肅萬州健順生物科技有限公司，蘭州 730070

由活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷在神經(jīng)退行性疾病中起了至關(guān)重要的作用［1］，H2O2是體內(nèi)代謝產(chǎn)生的一種ROS，能夠與多種生物靶標(biāo)分子(如DNA、蛋白、脂質(zhì))反應(yīng)，可以透過細(xì)胞膜［2-4］。大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞系PC12 廣泛用作研究氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型［5］。近年來，從天然產(chǎn)物中尋找具有清除自由基活性的物質(zhì)用于保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷備受關(guān)注［6］。

籽瓜，葫蘆科，性溫，有暖胃祛寒、滋嫩肌膚、清腎排毒等功效，富含果酸、核黃酸、尼可酸等18 種氨基酸、維生素及多種微量元素，具有利尿、潤肺、健脾的功效因子，對(duì)糖尿病、肥胖癥也有輔助醫(yī)療作用，籽瓜人藥可作“白虎湯”藥引［7-9］。植物多糖是一類由單糖組成的天然高分子化合物，如人參、枸杞、蘆薈、牛膝、刺五加等均具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、抗病毒作用等功能［10，11］。籽瓜多糖作為植物多糖的一種，已有報(bào)道其具有體外清除自由基的功效［12］，但確切機(jī)制不明。本研究在此背景下，探討SWP 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

籽瓜，產(chǎn)地為甘肅靖遠(yuǎn)，籽瓜切碎去除瓜子和瓜皮后粉碎得到籽瓜汁待用。

PC12 細(xì)胞購自昆明動(dòng)物所。DMEM 粉末(Gibco);青霉素(華北制藥股份有限公司);鏈霉素(大連美羅大藥廠);胰蛋白酶(上海華美生物工程公司);CCK-8 試劑盒(武漢博士德有限公司);MTT(Sigma-Aldrich 公司);乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、ROS 活性檢測(cè)試劑盒和caspase-3、caspase-9 活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);8-OHdG 檢測(cè)試劑盒(上海欣美生物試劑公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

NJC03-2 型微波提取設(shè)備(南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司);TDL5M 型臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)廠);LGJ-185 型真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific);Vi-cell 細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀(Beckman);生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司);倒置顯微鏡(OLYMPUS);SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(美國分子儀器有限公司);UV2450紫外分光光度計(jì)(上海美析儀器有限公司);熒光分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)，高速低溫離心機(jī)(Beckman);電子天平(天津市天馬儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 籽瓜多糖的制備

取一定量的準(zhǔn)備好的籽瓜汁，按照宋珅等［13］的方法分離和純化籽瓜多糖，苯酚硫酸法測(cè)得糖含量為93.1%，凝膠阻滯色譜法測(cè)得其分子量為121.3×105，GC-MS 法分析表明，SWP 由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖六種單糖組成，摩爾比為4.48∶13.14∶4.16∶7.82∶10.1∶60.3。

1.3.2 PC12 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)PCI2細(xì)胞，按每毫升104個(gè)細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，在37℃5% CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每2 d 換一次液。細(xì)胞為上皮樣貼壁生長，傳代時(shí)加0.25%的胰蛋白酶2～3 mL，在顯微鏡下觀察待細(xì)胞消化至剛從培養(yǎng)瓶底部脫落，加入含血清的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶3 每2～3 d 傳代一次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 H2O2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞氧化損傷模型的建立

按照李朝暉等［14］的方法確定H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的濃度和時(shí)間。細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為5×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度(100、300、500、700、1000 μmol/L)的H2O2處理細(xì)胞，設(shè)對(duì)照組，加入相同體積的不含H2O2的培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4、8、12、24 h，吸出培養(yǎng)液，加入無血清新鮮培養(yǎng)液100 μL 和CCK-8 試劑10 μL，輕微震蕩5 min，37 ℃孵育2 h，于450 nm 處用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算各組別細(xì)胞存活率。以對(duì)照組吸收度作為100%存活對(duì)照，不同組別吸光度值表示為對(duì)照組的百分比。

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率(%)=(A藥物-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%

實(shí)驗(yàn)組抑制率(%)=1-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率(%)

1.3.4 籽瓜多糖給藥劑量篩選

細(xì)胞消化，制成5×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔，設(shè)立對(duì)照組(不加入SWP，但加入相同體積的培養(yǎng)基)，籽瓜多糖組(3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL)，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入無血清新鮮培養(yǎng)液100 μL 及CCK-8 試劑10 μL，輕微震蕩5 min，37 ℃孵育2 h，于450 nm 處用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值。計(jì)算不同濃度SWP 對(duì)細(xì)胞的抑制率。確定籽瓜多糖給藥劑量范圍，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。以籽瓜多糖對(duì)細(xì)胞無毒性劑量范圍作為對(duì)細(xì)胞氧化損傷保護(hù)劑量范圍。

1.3.5 SWP 對(duì)H2O2損傷PC12 細(xì)胞活力的影響

按照上述方法處理細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度等體積的籽瓜多糖(10、25、50 mg/mL)，每組設(shè)六個(gè)復(fù)孔，分別孵育12、24、48 h 后，加入終濃度為500 μmol/L 的H2O2，繼續(xù)孵育24h，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活率。

1.3.6 LDH 釋放量的檢測(cè)

［15］的方法，分組培養(yǎng)細(xì)胞，背景空白對(duì)照孔為無細(xì)胞的培養(yǎng)液，孵育結(jié)束后，取各孔上清120 μL 于新的96 孔板中，再加入60 μL LDH 檢測(cè)工作液，避光室溫孵育30 min 后，在490 nm 處測(cè)量吸光度值。

計(jì)算公式:LDH(%)=(A樣品-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%

式中A樣品、A空白、A對(duì)照分別為樣品孔、空白對(duì)照孔和正常對(duì)照孔吸光度值。

1.3.7 胞內(nèi)ROS 檢測(cè)

采用ROS(reactive oxygen species)敏感熒光探針DCFH-DA 檢測(cè)胞內(nèi)ROS。細(xì)胞處理同1.3.5后，各孔加入DCFH-DA 至終濃度10μmol/L，于37℃繼續(xù)孵育4h，收集細(xì)胞，PBS 洗滌，制備單細(xì)胞懸液，加入1 mL 10 μmol/L 的DCFH-DA 無血清培養(yǎng)液，37 ℃孵育20 min。每3～5 min 顛倒混勻，使探針和細(xì)胞充分接觸。為除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，需無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞三次，然后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定(激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為521 nm)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。以對(duì)照組熒光強(qiáng)度為100%，其余各組與對(duì)照組熒光強(qiáng)度相比，計(jì)算胞內(nèi)ROS 變化。

1.3.8 8-羥基脫氧鳥苷酶聯(lián)免疫分析

應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平。參照郭春燕［16］方法，通過標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣—溫育—配液—洗滌—加酶—溫育—洗滌—顯色—終止—測(cè)定，嚴(yán)格按照8-OHdG 含量的檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3.9 線粒體膜電位的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期的PC12 細(xì)胞，消化后接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h 后按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的SWP 孵育12、24、48 h，然后加入終濃度為500 μmol/L 的H2O2，繼續(xù)孵育24 h，收集細(xì)胞，離心，棄上清，加細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，加0.5 mL JC-1 染色工作液，渦旋混勻，37 ℃孵育20 min，然后4 ℃800×g 離心3 min，棄上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌二次，200 μL 染色緩沖液重懸后，取100 μL 細(xì)胞懸液于96 孔板，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算比值。

1.3.10 Caspase-3、caspase-9 酶活性的檢測(cè)

按照1.3.4 處理細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度等體積的籽瓜多糖(10、25、50 mg/mL)，每組設(shè)六個(gè)復(fù)孔，孵育24 后，加入終濃度為500 μmol/L 的H2O2，繼續(xù)孵育24 h，收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解，重懸，冰浴裂解15 min。4 ℃16000×g 離心15 min。取上清，按照總體積100 μL 反應(yīng)體系加入待測(cè)樣品10 μL，Ac-DEVD-pNA 和Ac-LEHD-pNA 底物10 μL 的比例測(cè)定分別測(cè)定caspase-3、caspase-9 的酶活性。

1.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)結(jié)果均為計(jì)量單位，應(yīng)用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析，結(jié)果均以(±s)表示。P＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同濃度H2O2對(duì)PC12 細(xì)胞活率的影響(n=6)Table 1 Effect of different concentrations of H2O2on cell viability of PC12 cells(n=6)

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷濃度和時(shí)間的確定

CCK-8 結(jié)果如表1 所示，H2O2終濃度為100 μmol/L 時(shí)對(duì)細(xì)胞沒有明顯的損傷作用(P＞0.05)，H2O2終濃度為500 μmol/L 以上時(shí)，作用2h 細(xì)胞活力明顯下降(P＜0.01)，細(xì)胞毒性相對(duì)于正常細(xì)胞顯著增強(qiáng)，抑制率達(dá)20%，到12 h 抑制率為33%，作用24 h，對(duì)PC12 細(xì)胞抑制率約為35%，此時(shí)細(xì)胞受損但不至于大量死亡，所以H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的條件確定為500 μmol/L 損傷24 h。

2.2 SWP 單獨(dú)作用于PC12 對(duì)細(xì)胞增殖毒性的影響

采用CCK-8 法篩選SWP 對(duì)H2O2損傷保護(hù)劑量范圍，如圖1 所示，在所設(shè)置的五個(gè)濃度范圍內(nèi)，SWP 單獨(dú)作用于PC12 細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞基本無毒性，我們選定12.5、25、50 mg/mL 三個(gè)劑量來研究SWP 對(duì)H2O2損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用。

圖1 不同濃度SWP 對(duì)PC12 細(xì)胞活率的影響(n=6)Fig.1 Effect of different concentrations of H2O2on cell viability of PC12 cells(n=6)

圖2 不同濃度的籽瓜多糖對(duì)H2O2損傷PC12 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of different concentrations of SWP on H2O2-induced viability of PC12 cells

2.3 SWP 對(duì)H2O2損傷PC12 細(xì)胞活力的影響

如圖2 所示，與對(duì)照組相比，H2O2組的細(xì)胞活率明顯下降(P＜0.01)，與H2O2模型組相比，不同濃度(12.5～50 mg/mL)籽瓜多糖預(yù)處理后，能夠明顯改善H2O2引起的PC12 細(xì)胞存活率的降低(P＜0.01)，并且隨著作用時(shí)間和劑量濃度的增加，細(xì)胞存活率增加。說明籽瓜多糖，對(duì)H2O2損傷PC12 細(xì)胞的活力有一定的保護(hù)作用。

圖3 不同濃度的籽瓜多糖對(duì)H2O2損傷的PC12 細(xì)胞LDH 釋放量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of SWP on LDH leakage of PC12 cells injured by H2O2

2.4 LDH 釋放量的檢測(cè)

圖4 不同濃度的籽瓜多糖對(duì)H2O2損傷的PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.4 Effect of different concentrations of SWP on H2O2-induced intracellular accumulation of ROS in PC12 cells

如圖3 所示，與對(duì)照組相比，H2O2明顯引起了PC12 細(xì)胞膜的損壞，使得模型組細(xì)胞內(nèi)的LDH 大量外漏，而與模型組相比，加入籽瓜多糖預(yù)處理后，LDH 漏出量明顯降低(P＜0.01)，并且隨著SWP 濃度的升高和孵育時(shí)間的增加，LDH 釋放量減少，有一定的劑量和時(shí)間依賴性，表明SWP 能夠保護(hù)H2O2引起的細(xì)胞損傷。

2.5 SWP 對(duì)H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響

如圖4 所示，采用DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)胞內(nèi)ROS 變化情況。與對(duì)照組相比，500μmol/L H2O2單獨(dú)作用PC12 細(xì)胞24 h 后DCF 熒光信號(hào)顯著增高(P＜0.01)，即ROS 水平增加;而SWP 組(12.5、25、50 mg/mL)劑量依賴地抑制H2O2導(dǎo)致的胞內(nèi)ROS 水平的升高(P＜0.05)，并且隨著籽瓜多糖孵育時(shí)間的增加，這種抑制作用越明顯。表明SWP 能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞產(chǎn)生活性氧。

圖5 不同濃度的籽瓜多糖對(duì)H2O2損傷的PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.5 Effect of different concentrations of SWP on H2O2-induced 8-OHdG level in PC12 cells

2.6 SWP 對(duì)H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)8-OHdG 水平的影響

如圖5 所示，與對(duì)照組相比，500 μmol/L H2O2單獨(dú)作用PC12 細(xì)胞24 h 后，8-OHdG 水平顯著提高(P＜0.01);而籽瓜多糖提前孵育12、24、48 h 后，8-OHdG 水平顯著降低(P＜0.01)，有一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。表明SWP 能在一定程度上保護(hù)H2O2引起的細(xì)胞DNA 的損傷。

圖6 不同濃度的籽瓜多糖對(duì)H2O2損傷的PC12 細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.6 Effect of different concentrations of SWP on mitochondrial membrane potential induced by H2O2in PC12 cells

2.7 SWP 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的影響

如圖6 所示，與正常組相比，模型組中H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降(P＜0.01);與模型組相比，12.5、25、50 mg/mL SWP 提前孵育后，能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞線粒體膜電位下降(P＜0.01)，有一定的時(shí)間依賴性。

表2 籽瓜多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的caspase-3、caspase-9 酶活性的影響(n=6)Table 2 Effect of SWP on activities of caspase-3，caspase-9 of H2O2-induced PC12 cells(n=6)

2.8 SWP 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-9 酶活性的影響

如表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組中PC12 細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-9 酶的活性明顯增加(P＜0.01);而預(yù)先加入不同劑量SWP(12.5、25、50 mg/mL)處理后，caspase-3、caspase-9 酶的活性明顯下降(P＜0.05)，在12.5～50 mg/mL 濃度范圍內(nèi)有劑量依賴關(guān)系。表明SWP 可能通過影響Caspase 通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12 起到了保護(hù)作用

3 討論

本研究為了探討SWP 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用和機(jī)制，首先采用CCK-8 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷濃度和時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明500 μmol/L H2O2作用細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞活力抑制率為35%，該濃度下細(xì)胞有一定比例凋亡，但又不至于大量死亡，所以本研究選用500 μmol/L H2O2造模。為了篩選合適的SWP 量，我們?nèi)匀徊捎肅CK-8 方法，檢測(cè)SWP 單獨(dú)用藥對(duì)細(xì)胞無毒的劑量范圍。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了3 個(gè)劑量:12.5、25、50 mg/mL 對(duì)SWP 進(jìn)行保護(hù)作用和機(jī)制的研究。

我們進(jìn)行了DNA 損傷標(biāo)志物8-OHdG 的檢測(cè)，結(jié)果表明，與正常組相比，H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后8-OHdG 顯著增加僻;SWP 組與H2O2模型組相比，籽瓜多糖預(yù)孵育組8-OHdG 顯著降低。8-OHdG 是DNA 氧化損傷的重要標(biāo)志物，ROS 是造成DNA 氧化損傷主要原因之一，進(jìn)一步地我們檢測(cè)了ROS，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證明了該劑量范圍內(nèi)，SWP 的保護(hù)作用與清除活性氧，減輕DNA 損傷有關(guān)。細(xì)胞損傷時(shí)LDH 會(huì)釋放入培養(yǎng)液中，故其上清液中LDH 的濃度可反映出細(xì)胞的損傷程度，與正常對(duì)照組相比，H2O2能造成培養(yǎng)液中LDH 顯著提高;12.5～50 mg/mL SWP 能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的LDH 的提高。

ROS 會(huì)通過多種途徑造成線粒體的損傷，我們推測(cè)一定劑量范圍內(nèi)的SWP 對(duì)過氧化氫損傷的保護(hù)作用可能與線粒體途徑有關(guān)。于是我們測(cè)定了線粒體膜電位，結(jié)果表明12.5～50 mg/mL SWP 可以顯著的抑制H2O2造成的線粒體膜電位的下降。

Caspase 是一個(gè)在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-9 是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中比較上游的一個(gè)Caspase，激活的Caspase-9 可以激活細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵酶Caspase-3，Caspase-3介導(dǎo)的蛋白剪切是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的重要組成部分。另外，Caspase-3 在細(xì)胞核凋亡過程中也起到了關(guān)鍵作用，包括染色質(zhì)固縮，DNA 片段化等。為了探明Caspase 通路是否參與了SWP 對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12 的保護(hù)作用，我們檢測(cè)了 Caspase-3 和Caspase-9 活性。結(jié)果表明12.5、25、50 mg/mL SWP可以顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞Caspase-3 和Caspase-9 活性。

綜合以上結(jié)果分析12.5、25、50 mg/mL SWP 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除ROS，減輕DNA 氧化損傷，抑制線粒體膜電位下降，抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Caspase 通路的激活有關(guān)。研究結(jié)果提示，SWP 在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)于氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的治療可能有效。

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