羅明和，黃洪波，李沉紋，于彩平，馬俊英，盧來(lái)春*，鞠建華*

1 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所藥劑科，重慶 400042;2中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)科學(xué)院海洋微生物中心廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301

自上世紀(jì)50 年代從海洋來(lái)源的頭孢霉菌(Cephalosporium)分離得到頭孢菌素C 以來(lái)［1］，海洋真菌天然產(chǎn)物研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。海洋所獨(dú)具的低溫、高壓、高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)等特殊的環(huán)境，為海洋真菌產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的代謝產(chǎn)物提供了可能。目前從海洋真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定的新化合物已經(jīng)超過(guò)1000 個(gè)，并且數(shù)量還在不斷增加;其結(jié)構(gòu)類型主要是聚酮類和生物堿，其次是萜類、肽類。人們從這些數(shù)量眾多的海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中篩選到有藥用價(jià)值的、具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等活性的抗生素［2-4］。其中，Diketopiperazine halimide 最具有代表性，是由加州大學(xué)圣地亞哥分校的Fenical 研究小組發(fā)現(xiàn)的，它能抑制微管蛋白聚合，在此基礎(chǔ)上研發(fā)的該化合物的結(jié)構(gòu)類似物plinabulin(NPI-2358)正在進(jìn)行治療非小細(xì)胞肺癌的臨床二期研究［5，6］。

本課題組在對(duì)南海海洋來(lái)源真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的持續(xù)研究中，發(fā)現(xiàn)了一些新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物:從海洋來(lái)源曲霉屬真菌Aspergillus sp.SCSIO F063 分離獲得了少見(jiàn)的氯代及溴代蒽醌［7］，從蟲(chóng)草屬真菌Acremonium persicinum SCSIO 115 中分離獲得了具有細(xì)胞毒活性的環(huán)肽［8］，從炭角屬真菌Xylaria sp.SCSIO 156 中分離得到具有細(xì)胞毒活性的細(xì)胞松弛素［9］，從青霉屬真菌Penicillium sp.SOF 07中獲得了有免疫酶抑制劑活性的霉酚酸類化合物［10］。最近，我們發(fā)現(xiàn)一株南海海洋來(lái)源的真菌SCSIO 81-F2 的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633、蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis ATCC10792、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC29213 和大腸桿菌 Escherichia coli ATCC25922 具有抑菌活性。隨后，我們通過(guò)18S rDNA 序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，鑒定該菌株屬于曲霉屬真菌Aspergillus sp.。采用土豆培養(yǎng)基(PDB)發(fā)酵，利用抑菌活性追蹤與色譜層析技術(shù)相結(jié)合的方法從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得三個(gè)化合物，經(jīng)ESI-MS、1H/13C NMR 及X-單晶衍射分析鑒定為含異腈基的抗生素xanthocillin X dimethylether(1)、xanthocillin X monomethylether(2)、6'，8'-dimethoxy xanthocillin X dimethylether(3)。本文報(bào)道該菌株的分子生物學(xué)及由該菌株產(chǎn)生的異腈基類化合物的分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker DRX 500 核磁共振儀(500/125 MHz，TMS 為內(nèi)標(biāo));Bruker amazon SL 離子肼質(zhì)譜儀;Oxford Gemini A Ultra X-單晶衍射儀;Varian ProStar 210 高效液相色譜儀(配PDA 檢測(cè)器);YMC-pack ODS-A 色譜柱(250×10 mm，5 μm);HS-GF254硅膠薄層板(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司);色譜純乙腈(安徽時(shí)聯(lián)公司)，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

海洋真菌SCSIO 81-F2 是從中國(guó)南海北部深海沉積土中分離純化而來(lái)，菌種保存于中國(guó)科學(xué)院海洋微生物研究中心。

PDA 培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯(200 g/L)，切成小塊，加水煮沸30 min，砂布過(guò)濾，取濾液加葡萄糖(20 g/L)，海鹽(30 g/L)，2 % 瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

PDB 培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基配方中不加瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海洋真菌81-F2 的分子生物學(xué)鑒定

1.2.1.1 18S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增

用真菌18S 通用引物，ITS1:(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4:(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')［11］，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(20 μL):DNA 模板1 μL，10×Buffer 2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1.6 μL，ITS1 primer(10 μmol/L)0.4 μL，ITS4 primer(10 μmol/L)0.4 μL，HiFi(5U/μL)0.2 μL，ddH2O 14.4 μL。PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72℃延伸40 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保溫。

1.2.1.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定

用凝膠回收試劑盒(OMEGA)純化PCR 產(chǎn)物，克隆至pCR2.1 載體(INVITROGEN)上，18S rDNA序列由美吉生物技術(shù)有限公司測(cè)定。將測(cè)得的18S rDNA 序列進(jìn)行BLAST 分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)CLUSTAL X 軟件對(duì)海洋真菌菌株SCSIO 81-F2 及真菌中最相似菌株的18S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)，使用軟件MEGA4.0 中的Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［12，13］。

1.2.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

用250 mL 錐形瓶，每瓶加入50 mL PDB 培養(yǎng)基，從平板上接入海洋真菌81-F2 的菌絲體，于28℃、200 rpm 搖床上培養(yǎng)2 d 后分別轉(zhuǎn)入含200 mL PDB 培養(yǎng)基的1 L 錐形瓶中，于28 ℃、200 rpm 培養(yǎng)8 d。

1.2.3 抗菌活性檢測(cè)

取5 mg/mL 的樣品提取物DMSO 溶液5 μL，加到直徑為0.6 cm 無(wú)菌濾紙片上，置于生長(zhǎng)有枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633、蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis ATCC10792、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC29213 和大腸桿菌Escherichia coli ATCC25922 的LB 檢測(cè)平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌活性。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的提取和分離

發(fā)酵產(chǎn)物(6 L)于4000 rpm 離心10 min，分離得到上清液和菌絲體。取上清液及菌絲體分別用乙酸乙酯和丙酮萃取得少量粗提物進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果顯示菌絲體的萃取物有活性，上清液萃取物無(wú)活性。同時(shí)，HPLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌絲體的提取物有次級(jí)代謝產(chǎn)物色譜峰，而上清液中未見(jiàn)。于是棄去上清液，將菌絲體用丙酮萃取3 次，經(jīng)減壓濃縮后得菌絲體粗提物總浸膏6 g。采用正相柱層析，氯仿-甲醇體系梯度(100∶0，98∶2，96∶4，94∶6，92∶8，90∶10，8∶2，5∶5，V/V)洗脫，得到Fr.1～Fr.8 共8 個(gè)餾份，餾份Fr.1，F(xiàn)r.2 有抑菌活性。對(duì)餾份Fr.1 用常壓正相硅膠柱層析，乙酸乙酯-石油醚梯度(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50，V/V)洗脫，反復(fù)純化3次，最后用二氯甲烷對(duì)較純產(chǎn)物重結(jié)晶得到化合物1。Fr.2 采用正相柱層析，氯仿-甲醇梯度(100∶0，98∶2，96∶4，94∶6，92∶8，9∶1，V/V)洗脫，經(jīng)HPLC 檢測(cè)分析合并Fr.2-(2-5)，再對(duì)Fr.2-(2-5)用半制備高效液相色譜(CH3CN/H2O 30%～100% 梯度洗脫20 min，流速2.5 mL/min)純化，得到化合物2(tR=15.5 min)、3(tR=19.4 min)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

18S rDNA 序列分析表明菌株SCSIO 81-F2 與曲霉菌屬Aspergillus unguis DFFSCS009 及Aspergillus sp.SCSIOF063 菌株的18S rDNA 序列相似性較高，所以鑒定為Aspergillus sp.81-F2，其菌落形態(tài)見(jiàn)圖1，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

圖1 菌株SCSIO 81-F2 在PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)圖Fig.1 Phenotype of strain SCSIO 81-F2 on PDA-medium plate

圖2 基于18S rDNA 序列構(gòu)建的SCSIO 81-F2 與其他真菌菌種NJ 分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Neighbour-joining tree based on 18S rDNA sequences showing relationships between strain SCSIO 81-F2 and closely related members of fungi

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色塊狀晶體，(+)ESI-MS 給出分子準(zhǔn)離子峰m/z 317.1［M+H］+、339.0［M+Na］+及655.3［2M+Na］+，據(jù)此推測(cè)化合物1 的分子量為316。13C NMR 譜僅顯示8 個(gè)C 信號(hào)，含一個(gè)低場(chǎng)區(qū)信號(hào)δC173.3，一個(gè)連氧芳碳信號(hào)δC161.1，五個(gè)芳碳信號(hào)，一個(gè)連氧脂肪碳信號(hào)δC55.4，提示該化合物存在對(duì)稱結(jié)構(gòu)。1H NMR 譜揭示4 處質(zhì)子信號(hào)δH7.79、6.99、6.98、3.86，其積分比為2∶1∶2∶3，因此，推測(cè)其分子式為C20H16N2O2。進(jìn)而推斷13C NMR 譜中低場(chǎng)區(qū)碳信號(hào)δC173.3 可能為異腈基碳信號(hào)。再仔細(xì)分析1H NMR 譜信號(hào)，在低場(chǎng)區(qū)存在芳環(huán)的鄰位偶合系統(tǒng)δH7.79(d，J=8.5 Hz)、6.98(d，J=8.5 Hz)，推斷分子中可能含有對(duì)位取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu);δH6.99(s)為孤立烯鍵質(zhì)子信號(hào)，說(shuō)明分子中存在雙鍵;δH3.86(s)結(jié)合δC55.4 碳信號(hào)，推斷分子中存在甲氧基。經(jīng)查閱文獻(xiàn)［14］，與報(bào)道的xanthocillin X dimethylether 的波譜數(shù)據(jù)一致，故化合物1 鑒定為xanthocillin X dimethylether。經(jīng)培養(yǎng)獲得了化合物1 的單晶，進(jìn)一步運(yùn)用X-單晶衍射驗(yàn)證了化合物1 的結(jié)構(gòu)(圖4)。

1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.79(4H，d，J=8.8 Hz，H-5，5';9，9')，6.99(2H，s，H-3，3')，6.98(4H，d，J=8.8 Hz，H-6，6';8，8')，3.86(6H，s，H-10，10');13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:173.3(C-1，1')，161.1(C-7，7')，131.7(C-5，5';9，9')，127.4(C-3，3')，124.8(C-4，4')，116.1(C-2，2')，114.4(C-6，6';8，8')，55.4(C-10，10')。

圖3 化合物1 的X-單晶衍射結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The X-ray structure of compound 1

化合物2 黃色粉末，(+)ESI-MS 給出分子準(zhǔn)離子峰m/z 303.0［M+H］+、325.0［M+Na］+、655.3［2M+Na］+，推測(cè)化合物2 的分子量為302，較化合物1 少14 個(gè)質(zhì)量數(shù)，推斷其分子式為C19H14N2O2?；衔? 的1H NMR 譜在低場(chǎng)區(qū)有δH7.78與6.99(J=8.9 Hz)，7.71 與6.92(J=8.7 Hz)兩對(duì)典型的苯環(huán)鄰位質(zhì)子偶合系統(tǒng)，δH6.98 處有一個(gè)呈單峰的烯氫信號(hào)，δH3.89 存在一個(gè)甲氧基質(zhì)子信號(hào)。13C NMR 給出15 個(gè)碳信號(hào):低場(chǎng)區(qū)δC172.6，172.4 兩個(gè)碳信號(hào)，兩個(gè)連氧芳碳信號(hào)δC161.3 及159.5，10 個(gè)芳碳信號(hào)，以及一個(gè)連氧脂肪碳信號(hào)δC55.1。推斷化合物2 存在兩個(gè)對(duì)位取代苯環(huán)，兩個(gè)雙鍵，兩個(gè)異腈基，以及一個(gè)甲氧基，與化合物1 比較，少了一個(gè)甲氧基。經(jīng)查閱文獻(xiàn)［15］，與報(bào)道的波譜數(shù)據(jù)一致，故鑒定為Xanthocillin X monomethylether。

1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.78(2H，d，J=8.9 Hz，H-5，9)，7.71(2H，d，J=8.7 Hz，H-5'，9')，6.99(2H，d，J=8.9 Hz，H-6，8)，6.98(2H，s，H-3，3')，6.92(2H，d，J=8.7 Hz，H-6'，8')，3.89(3H，s，H-10);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:172.6(C-1)，172.4(C-1')，161.3(C-7)，159.5(C-7')，132.2(C-5'，9')，131.9(C-5，9)，128.3(C-3')，127.5(C-3)，125.1(C-4)，123.9(C-4')，116.4(C-2)，116.2(C-6'，8')，115.5(C-2')，114.7(C-6，8)，55.1(C-10)。

化合物3(+)ESI-MS 給出分子準(zhǔn)離子峰m/z 399.2［M+Na］+及775.2［2M+Na］+，因此化合物3 的分子量為376，推斷其分子式為C22H20N2O4。1H NMR 譜低場(chǎng)區(qū)給出苯環(huán)鄰位偶合體系的特征信號(hào)δH7.81(d，J=8.5 Hz)、6.99(d，J=8.5 Hz)，說(shuō)明分子中存在對(duì)位取代苯環(huán)。1H NMR譜還給出呈單峰的烯氫信號(hào)δH7.08、7.06、7.00，積分比為2∶1∶1，提示分子中存在兩個(gè)雙鍵，以及一個(gè)1，3，4，5-四取代苯環(huán);另外還有甲氧基質(zhì)子信號(hào)δH3.93 和3.88，積分比為3∶1，推斷分子中存在4 個(gè)甲氧基。13C NMR 譜低場(chǎng)區(qū)δC173.9 和δC173.4 對(duì)應(yīng)兩個(gè)異腈基碳，高場(chǎng)區(qū)在δC61.0、56.3、55.5 有三個(gè)甲氧基碳信號(hào)，其中56.3 處的信號(hào)顯著偏高，為兩個(gè)碳原子。經(jīng)比對(duì)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)［16］，發(fā)現(xiàn)與6'，8'-dimethoxy xanthocillin X dimethylether 的波譜數(shù)據(jù)一致，因此，化合物3 為6'，8'-dimethoxy xanthocillin X dimethylether。

1H NMR(CD3OD 500 MHz)δ:7.81(2H，d，J=8.5 Hz，H-5，9)，7.08(2H，s，H-5'，9')，7.06(1H，s，H-3)，7.00(1H，s，H-3')，6.99(2H，d，J=8.5 Hz，H-6，8)，3.88(3H，s，H-10)，3.93(9H，s，H-10'，11'，12');13C NMR(CDCl3125 MHz)δ:173.9(C-1)，173.4(C-1')，161.3(C-7)，153.3(C-6'，8')，140.0(C-7')，131.9(C-5，9)，131.8(C-3')，131.4(C-3)，128.2(C-4')，127.8(C-4)，127.4(C-2')，124.7(C-2)，114.5(C-6，8)，107.3(C-5'，9')，61.0(C-10')，56.3(C-11'，12')，55.5(C-10)。

圖4 化合物1、2、3 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structures of compounds 1，2 and 3

2.3 討論

Xanthocillin 最早于1950 從一株青霉Penicillium notatum Westling 的發(fā)酵產(chǎn)物中得到，并于1957年由Hagedorn 和Tonjes 確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)［17］。它們都帶有一個(gè)異腈基，具有很強(qiáng)的生物活性，是一類廣譜抗生素，能抑制大部分革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌以及部分真菌如大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、酵母菌等的生長(zhǎng)，并能抑制耐青霉素和磺胺類藥物的耐藥菌的生長(zhǎng)。但是由于它在哺乳動(dòng)物的胃腸中吸收很差，所以只能做成軟膏作為外用制劑使用。Xanthocillin 類化合物不具有溶血效應(yīng)，但是在劑量過(guò)大時(shí)會(huì)有神經(jīng)毒活性。報(bào)道最多的Xanthocillin X monomethylether 還能特異性的抑制花生四烯酸到前列腺素H2 的生物合成，它的衍生物對(duì)實(shí)體瘤也有很好的抑制活性，其成果已被日本的Hiroshi Kurihara 等申請(qǐng)專利保護(hù)［18，19］。另外有報(bào)道顯示Xanthocillin 作為促血小板生成素模仿物，能選擇性誘導(dǎo)c-Mpl-expressed UT-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)，極有可能開(kāi)發(fā)成促血小板生成的新藥物，Xanthocillin X monomethylether 同時(shí)還能誘導(dǎo)一些蛋白的磷?；?6］。本研究從一株海洋來(lái)源的真菌中分離獲得了Xanthocillin 類化合物，為該類化合物提供了新的來(lái)源，為其結(jié)構(gòu)改造和藥理藥效研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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