張 崢，葉小玉，肖 強(qiáng)，周大寨

生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北民族學(xué)院，恩施 445000

銀杏(Ginkgo biloba L.)是我國(guó)特產(chǎn)的銀杏科銀杏屬的孑遺植物［1］。銀杏葉提取物(簡(jiǎn)稱GBE)及其制劑具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、增強(qiáng)心肌收縮力、增加腦血流量、改善腦營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)神經(jīng)元等多種生物活性［2，3］;已被用于治療腦損傷后遺癥、老年性癡呆、衰老、神經(jīng)性疾病、帕金森病及老年性心血管系統(tǒng)機(jī)能衰退等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀杏主要有效成分為黃酮甙和銀杏內(nèi)酯類化合物;目前為止發(fā)現(xiàn)銀杏萜內(nèi)酯8 個(gè)，分別是銀杏內(nèi)酯(A、B、C、J、K、L、M)和白果內(nèi)酯(bilobalide)［4，5］，其中以銀杏內(nèi)酯A、B、C(簡(jiǎn)稱GA、GB、GC)和白果內(nèi)酯(bibobalide，簡(jiǎn)稱BB)為主，它們具有特異性的抗血小板活化因子(PAF)活性［3］。由于GBE 產(chǎn)品中銀杏內(nèi)酯的含量通常很低，常用的高效液相色譜檢測(cè)器(如紫外檢測(cè)器)靈敏度不夠，本底高且受其它雜質(zhì)干擾不能適用［5，6］;示差折光檢測(cè)器，一方面靈敏度比紫外檢測(cè)器還差，另一方面則由于分離內(nèi)酯時(shí)通常采用的梯度洗脫會(huì)產(chǎn)生基線漂移，容易造成定量不準(zhǔn)［4，7］，蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器(ELSD)靈敏度高，選擇性好，但其響應(yīng)是非線性，帶來(lái)定量誤差［8］，難以用于質(zhì)量控制中的定量分析。高效液相色譜(HPLC)與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了HPLC 分離和MS 定性的優(yōu)勢(shì)，TOF-MS 可以提供相對(duì)分子質(zhì)量的高精度信息，本文通過(guò)超高壓液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-TOF-MS)技術(shù)對(duì)銀杏內(nèi)酯進(jìn)行質(zhì)譜分析，采用其獨(dú)特的選擇離子流提取方式，提高了分析靈敏度，可在極短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)銀杏內(nèi)酯的快速定性和定量測(cè)定，滿足分析需要。

1 材料與儀器

1.1 材料

2012 年6 月對(duì)鄂西南各縣市銀杏品種母樹(shù)(經(jīng)恩施州林業(yè)科學(xué)研究所吳代坤高級(jí)工程師鑒定)采集銀杏葉，銀杏葉置烘箱及時(shí)烘干粉碎，過(guò)40 目篩備用。

1.2 儀器、藥品與試劑

Agilent 1290 液相色譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(6224型)配有電噴霧電離(ESI)源和大氣壓化學(xué)電離源(APCI);采用Agilent Masshunter 工作站和數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)信號(hào)進(jìn)行采集和數(shù)據(jù)處理。

銀杏內(nèi)酯樣品:銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)、白果內(nèi)酯(BB)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110862-201009、110863-200508、110864-200906、110865- 200605;甲酸(色譜純)、乙腈(色譜純):迪馬科技有限公司產(chǎn)品;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milipore，Bedford，MA，USA)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜分析條件

Agilent ZORBAX C18(2.1×50 mm，1.8 μm)色譜柱。流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序如下:0～5 min，20%～45%乙腈，柱溫25 ℃，流速0.2 mL/min。

2.2 質(zhì)譜分析條件

ESI 離子源負(fù)模式，干燥氣溫度350 ℃，流速10 L/min;霧化器壓力45 psig，毛細(xì)管電壓3500 V，毛細(xì)管出口電壓150 V，錐孔電壓65 V，采集速度1.5 spectra/s，選擇離子(EIC)采集模式，選定分子離子［M-H］-的質(zhì)荷比分別為407.15(GA)，423.15(GB)，439.12(GC)，325.11(BB)。

2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取對(duì)照品GA 1.052 mg、GB 1.294 mg、GC 1.009 mg、BB1.055 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，振搖使溶解，得銀杏內(nèi)酯對(duì)照品儲(chǔ)備液。取BB 1 mL，GA、GB、GC 各200 μL，用甲醇定容至10 mL 制成混合對(duì)照品溶液。實(shí)際使用時(shí)再用甲醇適當(dāng)稀釋。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系

將上述對(duì)照品溶液分別稀釋1.0、2.5、3.3、4.0、5.0 倍，按所設(shè)LC-MS 條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定進(jìn)樣量與相應(yīng)質(zhì)譜峰面積的關(guān)系。以內(nèi)酯的選擇性離子流色譜圖(見(jiàn)圖1)中峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的內(nèi)酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行直線回歸，求得GA、GB、GC、BB 的線性方程及相關(guān)系數(shù)，在0.2～4 μg/mL 范圍內(nèi)，4 種銀杏內(nèi)酯的線性關(guān)系如下:GA:Y=67940X-28506，R2=0.9999;GB:Y=2000000X+23738，R2=0.9996;GC:Y=2000000X+67415，R2=0.9996;BB:Y=57562X-9073，R2=0.9999。

圖1 GA、GB、GC、BB 的選擇離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms(EIC)of GA，GB，GC and BB

2.4.2 精密度與準(zhǔn)確性

按前述LC-MS 條件對(duì)同一混合標(biāo)樣重復(fù)測(cè)定4次，4 種內(nèi)酯的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 分別為GA:1.53%，GB:1.65%，GC:1.52%，BB:1.26%，說(shuō)明本方法較為準(zhǔn)確、可靠。

2.4.3 重復(fù)性

取銀杏葉樣品5 份，按照2.5 項(xiàng)下方法制備供試樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，記錄色譜圖。結(jié)果表明4 種內(nèi)酯的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均小于3.8%，符合定量分析要求，表明方法的重復(fù)性良好。

2.5 樣品制備

精確稱取銀杏葉樣品2.0 g，加入50%乙醇溶液置于索氏提取器中70 ℃提取2 h，冷卻抽濾，濾渣加入50%乙醇溶液再次提取2 h;合并兩次得到的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后加10 mL 蒸餾水及0.3 g乙酸鈉溶解，加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇溶解并定容至10 mL。

3 結(jié)果與分析

用前述方法對(duì)鄂西南不同銀杏品種葉片的4 種內(nèi)酯進(jìn)行了測(cè)定，經(jīng)回歸方程計(jì)算各種內(nèi)酯的含量，由表1 可見(jiàn)，不同品種間白果內(nèi)酯含量差異具有極顯著性，其中以恩銀23 號(hào)含量最高，較含量最低的恩銀1 號(hào)高出1 倍以上;4 種內(nèi)酯總含量在各品種間差異極顯著，其中，恩銀23 號(hào)總內(nèi)酯含量在四個(gè)品種最高;而恩銀2 號(hào)則最低。

表1 不同銀杏品種葉片白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯含量(n=3，±s)Table 1 The contents of bibobalides and gingkolides in the leaves of G.biloba from different species(n=3，±s)

表1 不同銀杏品種葉片白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯含量(n=3，±s)Table 1 The contents of bibobalides and gingkolides in the leaves of G.biloba from different species(n=3，±s)

注:同一欄內(nèi)數(shù)據(jù)后不同字母者在0.05 水平上差異顯著。Note:Values followed by a different letter were of significant difference at the 0.05 probability level.

4 討論

由于各種銀杏內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)很相似，且無(wú)特征紫外吸收，雖然在210 nm 處有紫外吸收，但此波長(zhǎng)與洗脫溶劑甲醇或乙腈紫外吸收截止波長(zhǎng)非常接近，容易造成紫外檢測(cè)背景值偏高。另外，一般情況下所測(cè)樣品中銀杏內(nèi)酯的含量非常低，對(duì)于靈敏度不高的檢測(cè)器，如紫外、示差等，樣品需反復(fù)多次提取、純化、濃縮，以提高銀杏內(nèi)酯的濃度，才能進(jìn)行檢測(cè)，如此眾多的環(huán)節(jié)往往帶來(lái)較大的檢測(cè)誤差?；谄渌鼨z測(cè)器存在的缺陷。作者采用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀作為檢測(cè)器，用液-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定量分析。由于它靈敏度很高，0.2 μg/mL 銀杏內(nèi)酯即可產(chǎn)生足夠的質(zhì)譜信號(hào)，解決了靈敏度問(wèn)題，且具有較好準(zhǔn)確性好;另一方面，紫外等檢測(cè)器對(duì)于性質(zhì)相近GA、GB 出現(xiàn)的共流出無(wú)能為力，不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量;從圖1 可見(jiàn)，在選定分離條件下，GA 和GB 存在共流出，但質(zhì)譜儀通過(guò)EIC 功能可以準(zhǔn)確定量共流出峰不同離子，從而做到同時(shí)準(zhǔn)確定量4 種主要銀杏內(nèi)酯。

液-質(zhì)聯(lián)用儀的質(zhì)譜采用軟電離方式，即電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)，在它的總離子流質(zhì)量色譜圖上能得到較強(qiáng)的分子離子峰(［M+H］+或［M-H］+，M 代表相對(duì)分子質(zhì)量);根據(jù)銀杏內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)中含有很多氧原子及活潑羥基，故選擇ESI 負(fù)離子采集方式。用自動(dòng)進(jìn)樣器直接進(jìn)樣，調(diào)節(jié)各參數(shù)，以得到最強(qiáng)的分子離子峰(［M-H］+)，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件;同時(shí)采用質(zhì)譜的EIC 選擇離子流提取方式提取色譜圖，即選定407.15(MGA-1)、423.15(MGB-1)、439.12(MGC-1)、325.11(MBB-1)4 個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行色譜提取，進(jìn)一步提高了銀杏內(nèi)酯的檢出靈敏度。

作者采用近年來(lái)迅速發(fā)展的UPLC-MS 方法，利用超高壓液相色譜實(shí)現(xiàn)微量樣品的迅速分離，本方法在4 分鐘內(nèi)即完成了四種主要銀杏內(nèi)酯的分離，較其它液質(zhì)聯(lián)用方法［9］相比，大大節(jié)約了洗脫溶劑的消耗，節(jié)省了寶貴的時(shí)間;采用TOF-MS 作為檢測(cè)器，發(fā)揮其靈敏度高、精密度與準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品中微量銀杏內(nèi)酯的定量檢測(cè)。基于上述方法，利用自動(dòng)進(jìn)樣器可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣品的快速準(zhǔn)確定量。

目前國(guó)際上一般公認(rèn)的銀杏葉制品質(zhì)量指標(biāo)為1991 年德國(guó)Schwabe 制藥廠生產(chǎn)的產(chǎn)品EGb761 標(biāo)準(zhǔn)，即黃酮苷24%以上，內(nèi)酯6%以上，銀杏酸10 mg/kg 以下。其中，3 種苷元的大體比例是3∶2.6∶1。內(nèi)酯中白果內(nèi)酯與萜內(nèi)酯的含量大致相等，而萜內(nèi)酯A、B、C 的比例約為2∶2∶1［10］。本研究表明，在恩銀23 號(hào)葉片中，4 種內(nèi)酯含量在4 個(gè)品種中最高，同時(shí)白果內(nèi)酯和萜內(nèi)酯的含量之比約為1.5:1，且萜內(nèi)酯A、B、C 的比例接近1.5∶1.5∶1，適合作為葉用銀杏品種開(kāi)發(fā)的優(yōu)選品種。

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