彭練慈，殷中瓊，康 帥，曲 徑，劉明輝，陳 萍

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，雅安 625014

無乳鏈球菌又稱B 群鏈球菌，可引起奶牛乳房炎。目前對于奶牛乳房炎的治療主要依賴于抗生素，但抗生素容易造成乳汁殘留，而且耐藥菌株也不斷出現(xiàn)［1，2］。中草藥具有抗菌、消炎、低毒和細菌不易產(chǎn)生耐藥性等特點，從傳統(tǒng)中草藥中篩選出有效的抗無乳鏈球菌藥物符合食品安全和公共衛(wèi)生需要。本實驗室前期試驗結(jié)果表明，黃連(Coptidis Rhizoma)、黃芩(Radix Scutellariae)和虎杖(PoLygonum cuspidatum)三味中藥的提取物對無乳鏈球菌有很好的抑菌效果，其抑菌效果明顯優(yōu)于某些抗菌的中藥材。為了提高三味中藥對無乳鏈球菌的抑菌活性，本研究對其有效物質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化，以便提高各味中藥有效物質(zhì)的產(chǎn)量達到更好的抑菌效果。

黃連為毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效［3］。其中主要有效成分是以小檗堿為代表的季銨型生物堿［4］，具有抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等作用［5］。因此黃連小檗堿的提取工藝研究對抗菌抗病毒及臨床研究有著重大的意義。

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效。主要成分是黃酮類化合物，其中黃芩苷、漢黃芩苷［6］、黃芩素等具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)作用以及較強的抗癌反應(yīng)等生理效應(yīng)［7］。黃芩苷是從黃芩根中分離的一種黃酮類化合物，具有顯著的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫、降血糖等藥理活性［8］。

虎杖為蓼科植物虎杖的干燥根莖及根，具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰等功效。虎杖中主要含有蒽醌類和芪類化合物，其中芪類成分白藜蘆醇具有抗菌、抗炎、抗癌、抗過敏、降血脂和抗氧化等多方面的藥理活性［9］。

目前，在對黃連、黃芩和虎杖三味藥的提取工藝研究中，以測定黃連的鹽酸小檗堿的含量［10］、黃芩的黃芩苷含量［11］、虎杖的白藜蘆醇含量［12］為指標的研究較多，以浸膏得率為指標的提取工藝研究較少，綜合文獻資料，本研究以提取溶劑濃度、料液比、提取次數(shù)、提取時間、提取溫度為影響因素，采用正交設(shè)計試驗，以浸膏得率及對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)值和最低殺菌濃度(MBC)為指標，對三味中藥提取工藝條件進行優(yōu)選研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材

黃連(產(chǎn)地四川，批次:080406)、黃芩(產(chǎn)地陜西，批次:040824)、虎杖(產(chǎn)地四川，批次:081102)3味中藥均購于四川雅安惠民堂藥業(yè)連鎖有限責任公司，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥學(xué)系副教授范巧佳鑒定為正品。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基

無乳鏈球菌編號為CVCC1886，購自中國獸藥監(jiān)察所。

加有5% 小牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，加有5% 小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基按照常規(guī)方法制作，用于無乳鏈球菌的培養(yǎng)。

1.1.3 儀器設(shè)備和試劑

電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、索氏提取器、微量加樣器、二甲亞砜、無水乙醇、T 型涂布棒、90mm 玻璃培養(yǎng)皿。

1.2 方法

1.2.1 虎杖、黃芩有效成分提取工藝的正交實驗設(shè)計

以料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取時間(C)及提取溫度(D)為考察對象，并根據(jù)相關(guān)文獻［13，14］，擬定各因素的三水平(見表1)，以提取有效物質(zhì)的浸膏得率，MIC 值和MBC 值為綜合考察指標，選用L9(34)正交試驗表進行試驗(見表2)，從而篩選出最佳的提取工藝。

按規(guī)定量稱取藥物9 份，每份約30 g，分別粉碎并編號1、2、3、4、5、6、7、8、9，精確稱量9 份藥物粉末，將精確稱量后的各藥物粉末于溶媒中加熱回流提取，為充分提取，每組都提取3 次，合并濾液并濃縮濾液至糊狀，放入55 ℃烘箱中3 d，直至烘干到恒重浸膏狀態(tài)，稱重并計算得率，封存?zhèn)溆?，分別重復(fù)9 次。

表1 虎杖、黃芩因素水平表Table 1 Factors and levels of the extraction conditions in extracting P.cuspidatum and Radix Scutellariae

1.2.2 黃連有效成分提取工藝的正交實驗設(shè)計

以料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取時間(C)及提取次數(shù)(D)為考察對象，并根據(jù)相關(guān)文獻［15］，擬定各因素的三水平(見表2)，以提取有效物質(zhì)的浸膏得率，MIC 值和MBC 值為綜合考察指標，選用L9(34)正交試驗表進行試驗(見表2)，從而篩選出最佳的提取工藝。

按規(guī)定量稱取藥物9 份，每份約30 g，分別粉碎并編號1、2、3、4、5、6、7、8、9，精確稱量9 份藥物粉末，將精確稱量后的各藥物粉末于溶媒中加熱回流提取，合并濾液并濃縮濾液至糊狀，放入55 ℃烘箱中3 d，直至烘干到恒重浸膏狀態(tài)，稱重并計算得率，封存?zhèn)溆茫謩e重復(fù)9 次。

表2 黃連因素水平表Table 2 Factors and levels of the extraction conditions in extracting Coptidis Rhizoma

1.2.3 正交試驗中藥有效成分的體外抑菌活性實驗

1.2.3.1 細菌菌懸液的制備

挑取新鮮培養(yǎng)無乳鏈球菌的單個典型菌落接種于3 mL 的TSB 肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)18～24 h 后取出。吸取菌液0.5mL，用生理鹽水作10-1梯度稀釋，取10-7、10-8、10-9三個梯度的菌液0.1 mL 分別在6 個TSA 培養(yǎng)基上均勻攤開，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。計算出原液的細菌個數(shù)為1.60×1011CFU/mL。

臨用前將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋成菌液濃度為1.60×107CFU/mL。

1.2.3.2 藥液的制備

精確稱取各正交試驗的中藥有效部位提取物浸膏溶于蒸餾水中，配制成生藥濃度為1 g/mL 的溶液，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.3.3 藥敏實驗

采用試管2 倍稀釋法，取20 支滅菌試管，分為第一組和第二組，每組9 支。20 管分別加TSB 肉湯1 mL。在兩組的第1 管分別加1 mL 藥液，混勻后吸取1 mL 至第2 管中，依次類推，直至第9 管，第9 管吸取1 mL 棄去。向第一組的9 支試管加0.1 mL 的稀釋菌液，另一組9 支試管不加細菌，加0.1 mL 生理鹽水作為陰性對照組。第19 管不加藥液加0.1 mL 細菌作為陽性對照，第20 管不加藥液和細菌作為空白對照。則兩組的第1 管至第9 管的藥液濃度依次為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60 mg/mL、7.80、3.90、1.95 mg/mL。置于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)18～24 h。以無菌生長的最低稀釋度為最小抑菌濃度(MIC)。

觀察藥物MIC 以上未見細菌生長的各管培養(yǎng)物，分別各取0.1 mL 移至不含藥的TSA 瓊脂平皿上，輕輕推開藥液，置37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察有無細菌生長。按一般規(guī)定，平皿培養(yǎng)基中，計數(shù)少于5 個菌落者作為該藥的最低殺菌濃度(MBC)。

1.2.4 最佳提取工藝下各味中藥提取物的體外抑菌活性試驗

按照“1.2.3”中的試驗方法，將篩選出的各味中藥在最佳提取工藝下的有效物質(zhì)進行體外抑菌活性的驗證。

2 實驗結(jié)果

2.1 虎杖最佳提取工藝的優(yōu)選

按照正交實驗設(shè)計的提取方法對虎杖進行有效物質(zhì)的提取，得到9 份虎杖有效提取物。通過對虎杖提取物各浸膏得率的計算及提取物對無乳鏈球菌MIC 值和MBC 值的測試，結(jié)果見表3 和表4。

表3 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標的試驗L9(34)直觀分析Table 3 The results of L9(34)tests by taking extraction yield and the sum of MIC and MBC as indexes

表4 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標的試驗L9(34)的方差分析Table 4 The variance analysis results of L9(34)tests by taking extraction yield and the sum of MIC and MBC as indexes

4 個因素對虎杖提取物浸膏得率的影響大小順序為D＞C＞A＞B，最優(yōu)水平組合為A2B2C3D2，即料液比為1∶6，乙醇濃度為70%，提取溫度95 ℃，一次2 h，提取3 次。對MIC、MBC 之和的影響順序為C＞A=D＞B，使MIC、MBC 之和最小的最優(yōu)水平為A1B1C2，3D1，即料液比為1∶5，乙醇濃度為60%，提取溫度85 ℃，一次提取1.5 或2 h，共提取3 次。

溫度對提取物浸膏得率的影響顯著，提取時間對MIC、MBC 之和的影響顯著。以浸膏得率，MIC、MBC 之和為指標時所得工藝的差異因素都是乙醇濃度，且料液比、乙醇濃度對其影響都不大，為節(jié)約成本，將料液比設(shè)定為1∶5，乙醇濃度為60%。溫度對浸膏得率的影響顯著，對MIC、MBC 之和的影響不大，所以設(shè)定溫度為95 ℃。為提取充分，將時間設(shè)定為2 h。所以篩選虎杖的最優(yōu)水平為A1B1C3D3，即料液比為1∶5，乙醇濃度為60%，提取溫度為95 ℃，一次2 h，共提取3 次。

2.2 黃芩最佳提取工藝的優(yōu)選

按照正交實驗設(shè)計的提取方法對黃芩進行有效物質(zhì)的提取，得到9 份黃芩有效提取物。通過對黃芩提取物各浸膏得率的計算及提取物對無乳鏈球菌MIC 值和MBC 值的研究，結(jié)果見表5 和表6。

表5 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標的試驗L9(34)直觀分析Table 5 The results of L9(34)tests by taking extraction yield and the sum of MIC and MBC as indexes

表6 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標的試驗L9(34)的方差分析Table 6 Analysis of variance of L9(34)tests by taking extraction yield and the sum of MIC and MBC as indexes

4 個因素對黃芩提取物浸膏得率的影響大小順序為A＞D＞B＞C，最優(yōu)水平組合為A3B1C3D3，即料液比為1∶10，乙醇濃度為55%，提取溫度為95℃，一次提取2 h，共提取3 次。對MIC、MBC 之和的影響順序為C＞B＞D＞A，使MIC、MBC 之和最小最優(yōu)水平組合為A3B1C3D3，即料液比為1∶10，乙醇濃度為55%，提取溫度為95 ℃，一次提取2 h，共提取3 次。

4 個因素對黃芩提取物浸膏得率及MIC、MBC之和的影響均不顯著，所以篩選黃芩的最優(yōu)組合為A3B1C3D3，即料液比為1∶10，乙醇濃度為55%，提取溫度為95 ℃，一次提取2 h，共提取3 次。

2.3 黃連最佳提取工藝的優(yōu)選

按照正交實驗設(shè)計的提取方法對黃連進行有效物質(zhì)的提取，得到9 份黃連有效提取物。通過對黃連提取物各浸膏得率的計算及提取物對無乳鏈球菌MIC 值和MBC 值的研究，結(jié)果見表7 和表8。

表7 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標的試驗L9(34)直觀分析Table 7 The results of L9(34)tests by taking extract yield and the sum of MIC and MBC as indexes

表8 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標的試驗L9(34)的方差分析Table 8 Analysis of variance of L9(34)tests by taking extract yield and the sum of MIC and MBC as indexes

4 個因素對黃連提取物浸膏得率和MIC、MBC之和的影響大小順序為D＞C＞B＞A，以得率為指標的最優(yōu)水平組合為A1B3C2D2，即料液比1∶8，乙醇濃度80%，1.5 h 一次，提取2 次。以MIC、MBC 之和最小為指標的最優(yōu)水平組合為A2B3C2D2，即料液比為1∶10，乙醇濃度80%，1.5 h 一次，提取2 次。

4 個因素對黃芩提取物浸膏得率及MIC、MBC之和的影響均不顯著，以浸膏得率，MIC、MBC 之和為指標時所得工藝的差異因素都是料液比，料液比對浸膏影響很小，為節(jié)約成本，將料液比設(shè)定為1∶8。所以選擇黃連的最優(yōu)水平為A1B3C2D2，即料液比為1∶8，乙醇濃度80%，1.5 h 一次，提取2 次。

2.4 在最佳提取工藝下各味中藥提取物的體外抑菌活性

3 味中藥在本研究篩選出的最佳提取工藝下得到的浸膏物質(zhì)對無乳鏈球菌的MIC、MBC 值3 次結(jié)果的平均值見表9。

3 討論

黃連、黃芩、虎杖具有良好的抗無乳鏈球菌作用。文獻中對中藥材提取方法的選擇不盡相同，通常只會選擇一種提取方式。中藥化學(xué)成分非常復(fù)雜，抗菌成分也多種多樣，不同的提取方式會提取出不同的成分，同時抑菌效果也會不盡相同。在影響中藥提取質(zhì)量的系列因素中，溶媒量、提取時間、提取次數(shù)為主要因素。所以本研究采用正交設(shè)計實驗，綜合考慮溶劑濃度、料液比、提取次數(shù)、提取時間、提取溫度5 種因素對3 種中藥有效物質(zhì)提取質(zhì)量的影響效果。在正交試驗設(shè)計中，黃芩和虎杖均提取3 次，使其中藥里的成分得到了充分的提取。

表9 最佳提取工藝下的3 中藥對無乳鏈球菌的MIC 值和MBC 值(單位:mg/mL)Table 9 The MIC and MBC against S.agalactiae under the optimal extraction conditions of 3 traditional Chinese medicines(unit:mg/mL)

黃連、黃芩和虎杖有效物質(zhì)最佳提取工藝較嚴格的選擇標準為高效液相色譜法分別定量測定其中單一有效物質(zhì)含量［10-12］。但本研究不是為了提取分離所得到的有效物質(zhì)，只為從少量的原料藥材中得到更多的抑菌效果好的有效物質(zhì)，因而便以濃縮蒸干之后的浸膏得率及其最低抑菌濃度值(MIC)和最低殺菌濃度值(MBC)為綜合評價指標，從中篩選出抑菌活性優(yōu)異的提取方法及條件。MIC 值和MBC 值是評價藥物對細菌抑菌效果的有效指標，MIC、MBC 值之和越小，其抑菌效果越好。

據(jù)文獻報道，按照一般的提取方法，黃連、黃芩和虎杖對無乳鏈球菌的MIC 分別為31.25、7.8 0、15.60 mg/mL［16］。在本研究中，黃連的MIC 和MBC值均為26.04 mg/mL，黃芩的MIC 和MBC 值為5.20、6.50 mg/mL。虎杖正交試驗的藥敏實驗結(jié)果中，MIC 值的范圍為15.60～31.25 mg/mL，MBC 值的范圍是15.60～62.50 mg/mL，驗證試驗中虎杖的MIC 值為15.60 mg/mL，MBC 值在15.60～62.50 mg/mL 范圍內(nèi)。說明黃連、黃芩、虎杖在最佳提取工藝下的有效物質(zhì)抑菌效果明顯強于一般提取工藝的有效物質(zhì)。因此，篩選出的抗無乳鏈球菌的最佳提取工藝的提取方法可行，且簡便易行的評價方法也為以后的中藥提取研究擴寬了方向，值得推廣使用。

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