衛(wèi)智權(quán)，閻 莉*，鄧家剛*，鄧 靜

1廣西中藥藥效研究重點實驗室廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧530001;2哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dana-Farber癌癥研究所，馬薩諸塞州02115

芒果葉為漆樹科植物芒果Mangifera indica L．的葉，芒果苷(mangiferin)是芒果葉中的主要活性成分，是一種天然多酚類化合物，分子式C19H18O11，分子量422，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

芒果葉在廣西民間用于治療咳嗽、咳痰已有多年歷史，成藥芒果苷片對于支氣管炎的咳嗽、咳痰、喘息、發(fā)熱等癥狀具有顯著療效且安全性良好［1］。芒果苷對多種急慢性炎癥具有較好抗炎作用，其作用機制與其明顯抑制單核-巨噬細胞的活化密切相關(guān)［2，3］。CD4+T 淋巴細胞對于慢性支氣管炎的病理進程具有重要影響，活化的CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生IL-2、IL-4等淋巴因子并進而活化B細胞、NK細胞、單核-巨噬細胞等重要的炎癥細胞，是參與支氣管及其周圍組織慢性炎癥的主要的炎癥細胞之一。迄今尚無芒果苷影響慢性支氣管炎中的CD4+T淋巴細胞的研究報道。香煙煙熏能夠建立類似于人慢性支氣管炎的動物模型，本研究擬以香煙煙熏誘導(dǎo)慢性支氣管炎大鼠為研究對象，觀察芒果苷對慢性支氣管炎大鼠CD4+T淋巴細胞的影響。

圖1 芒果苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure ofmangiferin

1 材料與儀器

1．1 實驗動物

SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，6周齡，體重160～180 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2011-0003］。

1．2 藥品及試劑

芒果苷由廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥效研究重點實驗室惠贈，經(jīng)高效液相色譜法檢測純度為97．5%，色譜圖見圖2。香煙(廣西卷煙總廠，焦油含量12 mg/支)。IL-2與IL-4 ELISA Kit(武漢華美公司)。Anti-rat CD3-PE抗體、Anti-rat CD4-APC抗體(美國Life technologies公司)，10×RBC Lysis Buffer(Multi-species)紅細胞裂解液(美國eBioscience公司)，RNeasy Plus Mini Kit(德國 Qiagen公司)，RNAstore樣本保存液、RNAsafe RNase抑制劑、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix(Probe)預(yù)混試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］。PCR引物、TaqMan熒光探針、質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品由美國Invitrogen公司設(shè)計、合成。

圖2 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品(A)與樣品(B)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mangiferin standard(A)and mangiferin sample(B)

1．3 儀器設(shè)備

美國Thermo Fisher Scientific公司Multiskan Speetrum1500酶標(biāo)儀，德國Qiagen公司QIAcube核酸純化儀，美國ABI公司7500型實時熒光PCR儀，德國Eppendorf公司5430R高速冷凍離心機，美國Becton Dickinson公司LSR Fortessa多色分析流式細胞儀與FACSAria高速流式細胞分選儀。

2 實驗方法

2．1 動物分組、給藥與標(biāo)本采集

大鼠40只隨機均分為4組:正常(Control)組、模型(Model)組及芒果苷高、低劑量(MFH、MFL)組。除正常組外，在0．25立方米玻璃倉內(nèi)每次用10支香煙煙熏各組大鼠，每天2次，上下午各1 h，連續(xù)6周。煙熏6周后開始灌胃給藥，正常組、模型組給生理鹽水，根據(jù)參考文獻報道的藥物劑量設(shè)置其余各組大鼠給藥劑量［4］:芒果苷高、低劑量組分別為芒果苷200、100 mg/(kg·d)，給藥時間4周，每天給藥后照常煙熏。

實驗第10周末，各組大鼠腹腔注射2% 戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，下腔靜脈穿刺取血，用于分選CD4+T淋巴細胞及CD4+T淋巴細胞比例檢測;取左肺組織用于HE染色觀察支氣管炎癥病理形態(tài)變化。

2．2 外周血CD4+淋巴細胞比例檢測

取EDTA-K2抗凝全血 100μL，加入 Anti-rat CD3-PE抗體、Anti-rat CD4-APC抗體各5μL，混勻，置4℃避光反應(yīng)30 min。加入紅細胞裂解液溶解紅細胞，反應(yīng)10 min后，1000 rpm離心5 min，棄上清，加PBS洗滌2次去除細胞碎片和未結(jié)合的抗體。緩慢加入1%多聚甲醛固定液0．5 mL，4℃ 避光固定30 min，過400目細胞篩，立即上機檢測。

2．3 CD4+T淋巴細胞分選

取適量EDTA-K2抗凝全血，加入Anti-rat CD3-PE抗體、Anti-rat CD4-APC抗體，混勻，置4℃ 避光反應(yīng)30 min，加入紅細胞裂解液溶解紅細胞，反應(yīng)10 min后，1000 rpm離心5 min棄上清，加PBS洗滌2次去除細胞碎片和未結(jié)合的抗體，少量PBS重懸，立即上機進行細胞分選，以CD3-PE+并CD4-APC+設(shè)門圈選CD4+T淋巴細胞。分選所得細胞懸液調(diào)整細胞濃度至5×106/mL，置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．4 ELISA檢測CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4蛋白表達水平

取CD4+T淋巴細胞懸液標(biāo)準(zhǔn)樣品2 mL，4℃離心(10000 rpm，1 min)，吸去上清，加入4℃預(yù)冷的細胞裂解勻漿緩沖液(pH 6．8的1．0 mmol/L Tris-HCl 20 mL，10%SDS 120 mL，β-巰基乙醇 4 mL，雙蒸水56 mL，混勻即得)，超聲冰浴勻漿破碎細胞，然后4℃離心(12000 rpm，15 min)，取上清液作為待測樣品。采用IL-2、IL-4的ELISA Kit，嚴格按照試劑盒說明書操作，以Curve Expert1．3曲線擬合軟件計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計算樣品中IL-2、IL-4的含量。

2．5 Real-time RT-PCR檢測CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因表達水平

取CD4+T淋巴細胞懸液標(biāo)準(zhǔn)樣品2 mL，以RNeasy PlusMini Kit總RNA提取試劑盒與QIAcube核酸純化儀提取總RNA。在RNA溶液中加入1/20體積的 RNAsafe，60℃處理20 min以使污染的RAase失活，冷卻至室溫后置于-70℃ 保存。提取的總RNA以Quant cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，于-70℃保存供下游PCR用。

目的基因IL-2與IL-4引物序列、TaqMan熒光探針序列見表1。每個PCR反應(yīng)體系內(nèi)容如下:2．5×Real Master Mix 20 μL，20 ×Probe Enhancer solution 2．5 μL，上、下游引物各 2 μL，cDNA 或質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品4μL，TaqMan熒光探針2μL，ddH2O加至50μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min，95℃變性20 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。

表1 引物序列和探針序列Table 1 Primer and probe sequence used in real-time RT-PCR

2．6 HE染色細支氣管炎癥病理形態(tài)觀察

各組大鼠左肺組織標(biāo)本行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫水，HE染色，光鏡下觀察細支氣管炎癥病理改變。

2．7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，以SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行多個樣本間均數(shù)比較。方差齊性數(shù)據(jù)采用單因素方差分析LSD檢驗，方差不齊數(shù)據(jù)采用 Kruskal Wallis秩和檢驗。以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3．1 芒果苷對外周血CD4+T淋巴細胞比例的影響

圖3 各組大鼠CD4+T淋巴細胞分析流式散點圖Fig.3 CD4+T lymphocyte analysis flow cytometry scatter plot of rats in each group

與正常組比較，模型組大鼠外周血CD4+T淋巴細胞比例明顯升高(P＜0．01)。與模型組比較，200 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)芒果苷均可抑制煙熏引起的CD4+T淋巴細胞比例升高(P＜0．01，P＜0．05)。結(jié)果見圖3、圖4。

3．2 芒果苷對CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因與蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因表達水平及蛋白表達水平顯著上調(diào)(P ＜0．01)。與模型組比較，200 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)芒果苷可抑制煙熏引起的CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4的基因與蛋白表達水平上調(diào)(P＜0．01，P ＜0．05)。結(jié)果見圖5。

圖4 各組大鼠CD4+T淋巴細胞比例Fig.4 CD4+T lymphocyte percentage of rats in each group

圖5 各組大鼠CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因和蛋白表達水平Fig.5 IL-2 and IL-4 expressions of CD4+T lymphocyte of rats in each group

3．3 HE染色支氣管炎癥病理形態(tài)觀察

正常組細支氣管的管壁結(jié)構(gòu)完整，無明顯淋巴細胞浸潤。模型組細支氣管壁可見多量淋巴細胞浸潤甚至淋巴濾泡形成，管壁結(jié)構(gòu)有局灶性腫脹、增厚、斷裂。200 mg/(kg·d)芒果苷組細支氣管結(jié)構(gòu)大致完整，少量淋巴細胞浸潤。100 mg/(kg·d)芒果苷組細支氣管結(jié)構(gòu)也存在局灶性腫脹、增厚、斷裂，中度淋巴細胞浸潤。結(jié)果見圖6。

圖6 HE染色支氣管炎癥病理組織鏡檢(×400)Fig.6 Rat histologic section of chronic bronchitis in each group(HE staining，×400)

4 討論

目前制備慢性支氣管炎模型的方法有二氧化硫吸入法、香煙煙薰法、脂多糖氣管內(nèi)注入法等，其中二氧化硫吸入法、脂多糖氣管內(nèi)注入法存在較多并發(fā)癥，與人類慢性支氣管炎在病因?qū)W、病理學(xué)與病理生理學(xué)方面均存在較大差距，且無法直接反映吸煙與慢性支氣管炎的關(guān)系，故近年已較少用于制備慢性支氣管炎動物模型，因而本實驗采用了已被廣泛應(yīng)用的香煙煙薰法制備慢性支氣管炎動物模型。對照組大鼠在接受10周的香煙煙熏之后，其肺組織的HE染色病理觀察表現(xiàn)出了較為明顯的慢性支氣管炎的特征性變化:多量淋巴細胞浸潤甚至淋巴濾泡形成，管壁結(jié)構(gòu)有局灶性腫脹、增厚、斷裂。因而可以認為香煙煙熏制備慢性支氣管炎大鼠模型是成功的。

世界衛(wèi)生組織和世界銀行的資料顯示，因慢性支氣管炎導(dǎo)致的慢性阻塞性肺病的死亡率居所有死因的第4位，且有逐年增加的趨勢［5］。慢性支氣管炎的基本病理基礎(chǔ)是氣道炎癥，涉及IL-2、IL-4等多種炎癥細胞因子，其介導(dǎo)的細支氣管炎癥在慢性支氣管炎的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。IL-2、IL-4是主要由活化的CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子，可活化更多的CD4+T淋巴細胞，促進B細胞增殖、分化，增強NK細胞殺傷活性，激活單核-巨噬細胞［6］。此外，IL-2、IL-4可協(xié)同IL-3刺激肥大細胞增殖，誘導(dǎo)IgG、IgE大量產(chǎn)生，從而介導(dǎo)氣道高反應(yīng)性的病理過程，與喘息性慢性支氣管炎密切相關(guān)［7］。因此，CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生IL-2、IL-4的多寡往往與慢性支氣管炎的CD4+T淋巴細胞活化程度呈同向性變化，成為考察慢性支氣管炎的T淋巴細胞活化程度的有效指標(biāo)。本研究中的模型組組大鼠在接受長達10周的香煙煙熏之后，其CD4+T淋巴細胞的IL-2、IL-4基因與蛋白表達水平均持續(xù)于較高水平，表明其CD4+T淋巴細胞活化也較為劇烈。

CD4+T淋巴細胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅在慢性支氣管炎的急性發(fā)作期，在慢性遷延期浸潤支氣管粘膜與粘膜下組織的CD4+T淋巴細胞數(shù)量也是增加的［8］。慢性遷延期的患者肺內(nèi)仍存在一定程度的炎癥活動，外周血CD4+T淋巴細胞增加，機體仍然持續(xù)處于不同程度的炎癥損傷之下［9，10］。這些T淋巴細胞亞群的病理性變化也是慢性支氣管炎能夠持續(xù)存在并反復(fù)發(fā)作的重要原因之一。本研究中的模型組大鼠的CD4+T淋巴細胞比例明顯升高，顯然與其支氣管炎癥持續(xù)活躍密切相關(guān)，其HE染色細支氣管炎癥病理形態(tài)觀察可見多量淋巴細胞浸潤的結(jié)果也支持此推論。

在本研究中，接受芒果苷干預(yù)的大鼠其HE染色組織病理形態(tài)觀察均可見到較為明顯的細支氣管炎癥減輕，其抗炎效果呈明顯的劑量依賴性，較高的芒果苷劑量可帶來更好的抗炎效果。同時觀察到的芒果苷干預(yù)抑制CD4+T淋巴細胞活化，包括CD4+T淋巴細胞比例以及CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因與蛋白表達水平顯著下調(diào)，也呈現(xiàn)不同程度的劑量依賴性。上述結(jié)果提示，芒果苷能夠以劑量依賴性的方式抑制CD4+T淋巴細胞活化，顯著減輕香煙煙熏誘導(dǎo)的大鼠慢性支氣管炎的炎癥細胞浸潤、支氣管及其周圍組織的損傷，具有較為良好的抗炎及組織保護作用，這些新的實驗證據(jù)顯著增加了芒果苷在慢性支氣管炎治療新藥研發(fā)領(lǐng)域的潛在價值。

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