武 倩 ，魏 蕾，司馬學(xué)琴，張 濤，甘亞平，蔣汝剛，劉復(fù)興，寧志豐＊＊

(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071;2.湖北科技學(xué)院護(hù)理學(xué)院;3.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

放療是晚期轉(zhuǎn)移性膀胱癌的主要治療手段之一，然而放療的不敏感和癌干細(xì)胞對(duì)放療的內(nèi)在抵抗性常常導(dǎo)致治療失敗。在本研究中，我們?cè)u(píng)價(jià)了沉默ABCG2 是否能夠增強(qiáng)膀胱癌T24 對(duì)X線的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌細(xì)胞株T24 購自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物典藏中心。RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)、雙抗購買自Hyclone 公司。MTT 購買自Gibco 公司，Transwell 板購買自Coming 公司，Matri 膠為Sigma 公司產(chǎn)品，siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。Lipofectamine 2000 購買自Invitrogen 公司?？谷薃BCG2 一抗購自Abcam 公司，二抗購自武漢博士德公司。其他試劑為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用RPMI 1640 培養(yǎng)基添加10% 胎牛血清、100 U 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的方法將膀胱癌T24 培養(yǎng)在37℃、恒溫恒濕的CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至85%左右時(shí)予以傳代。

1.3 轉(zhuǎn)染 將20 μmol/L 的siRNA 8 μl 稀釋于250 μl 無血清1640，輕輕混勻，室溫孵育5 min。加入8 μl Lipofectamine 2000，室溫孵育5min。將siRNA 稀釋液與Lipofectamine 2000 稀釋液混勻，總體積500 μl，室溫孵育20min。轉(zhuǎn)染前1d 將細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板。接種密度為1 ×105個(gè)/孔，使得次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合達(dá)60%～70%。Western blot 檢測(cè)沉默效果。

1.4 MTT 將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞各5000 個(gè)種入96 孔板，于種板后的第2d 予以4 Gy X 線照射2 h，常規(guī)培養(yǎng)4d，MTT 法檢測(cè)吸光值。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞各500 個(gè)種入6 孔板，于種板后的第2d 予以4 Gy X 線照射2 h，常規(guī)培養(yǎng)10d，吸取培養(yǎng)基后予以甲醇固定，0.1% 結(jié)晶紫予以染色15 min，計(jì)數(shù)肉眼可見的克隆數(shù)，克隆形成率(%)=陽性克隆數(shù)/種板細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 遷移實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度調(diào)至1 ×106個(gè)/ml，各500000 個(gè)種入Transwell 小室上室，體積為200 μl，培養(yǎng)基為無血清1640，下室內(nèi)加入500 μl 含15% FBS 的1640，培養(yǎng)12～17h 后，結(jié)束培養(yǎng)，取出小室，以棉簽輕輕擦去小室內(nèi)細(xì)胞，剪下基膜，甲醇固定后，0.1%結(jié)晶紫予以染色，鏡下計(jì)數(shù)10 個(gè)高倍視野中穿過基膜的細(xì)胞。

1.7 侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，不同的是小室內(nèi)鋪有Matrigel 膠，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到20～24h。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，以配對(duì)t 檢驗(yàn)來分析經(jīng)X 線照射沉默ABCG2 前后的變化，以Graphpad prism 5.0 來行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，P ＜0.05 被認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 干擾效果檢測(cè) 我們利用在線設(shè)計(jì)工具，設(shè)計(jì)了針對(duì)ABCG2 的3 對(duì)siRNA，siRNA 序列分別為:siRNA 1#:5＇-ACAAUUAAGGAUGUAAAUGUU-3＇，siRNA 2#5＇-UCUUUUCAGCUUAAUAGAGCU-3＇，siRNA 3#5 ＇-AUAAUAUUUCUUUCUCAACUG-3 ＇，Western blot 檢測(cè)結(jié)果提示siRNA 3#干擾效果最明顯。接下來的功能試驗(yàn)均選用siRNA 3#。

2.2 經(jīng)X 線照射，沉默ABCG2 后T24 的存活能力顯著減弱 MTT 結(jié)果提示，經(jīng)X 線照射，沉默ABCG2 后T24 的存活能力減弱，表現(xiàn)為OD 值顯著下降(P=0.0186，圖1)。

圖1 MTT

2.3 經(jīng)X 線照射，沉默ABCG2 后T24 的克隆形成能力顯著減弱 如圖2 所示，經(jīng)X 線照射，沉默ABCG2 后T24 的平板克隆形成能力下降(P=0.0030)。

圖2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

2.4 經(jīng)X 線照射，沉默ABCG2 后T24 的遷移能力顯著減弱 如圖3 所示，經(jīng)X 線照射，沉默ABCG2 后T24 的遷移能力下降(P=0.0007)。

圖3 遷移實(shí)驗(yàn)

2.5 經(jīng)X 線照射，沉默ABCG2 后T24 的侵襲能力顯著減弱 如圖4 所示，經(jīng)X 線照射，沉默ABCG2 后T24 的侵襲能力下降(P=0.0237)。

圖4 侵襲實(shí)驗(yàn)

3 討論

放療是治療晚期轉(zhuǎn)移性腫瘤的主要手段之一，膀胱癌亦是如此。有研究表明［1］，中晚期膀胱癌根治性放療能夠取得和根治性手術(shù)切除同樣的遠(yuǎn)期療效，前者甚至更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榍罢吣軌虿糠直Ａ舭螂椎呐拍蚬δ?，但是患者最終還是會(huì)死于放療抵抗。

對(duì)于放療抵抗的機(jī)制目前還不是很清楚?？梢砸浴?R”模式來部分解釋放療抵抗的機(jī)制，即DNA 損傷的修復(fù)、細(xì)胞周期的重新分布、癌細(xì)胞的重新克隆、低氧腫瘤區(qū)域的重新氧化。癌干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤放療抵抗的重要來源。越來越多的研究證實(shí)了這一點(diǎn)［2，3］，但是不明確ABCG2 在放療抵抗中的作用。我們推測(cè)ABCG2 是膀胱癌放療抵抗的分子決定物。

在本研究中，我們使用siRNA 轉(zhuǎn)錄后沉默膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株T24 中的ABCG2，經(jīng)免疫印跡檢測(cè)，沉默效率可達(dá)85%左右，可有效干擾ABCG2 的表達(dá)，從而抑制ABCG2 對(duì)其下游信號(hào)通路的調(diào)控。Xie 等［4］研究表明在喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2 和Hep-2T 中沉默ABCG2 的表達(dá)可顯著抑制增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展，cyclin D3 的下調(diào)和p21 Cip1的上調(diào)是其可能的分子機(jī)制，說明ABCG2 可能位于增殖信號(hào)通路和細(xì)胞周期調(diào)控節(jié)點(diǎn)的上游。有關(guān)ABCG2 上游調(diào)控通路的研究較多，例如，Ishikawa 等［5］發(fā)現(xiàn)由基因NFE2L2 編碼的轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 可以上調(diào)許多靶基因，包括與代謝相關(guān)的酶和與細(xì)胞防御有關(guān)的轉(zhuǎn)座子，近來更有研究發(fā)現(xiàn)NF-E2 可以與定位在ABCG2 啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件相互作用從而調(diào)控ABCG2 的表達(dá)。

盡管ABCG2 在癌癥放療抵抗中的作用未明，但是近來人們已經(jīng)注意到它在腫瘤光動(dòng)力療法中的作用，說明ABCG2 的作用除了與耐藥及干細(xì)胞表型有關(guān)外，還與光療等其它形式的細(xì)胞毒性療法有關(guān)。Hagiya 等［6］發(fā)現(xiàn)有部分胃癌細(xì)胞系對(duì)光敏感，部分細(xì)胞系不敏感，肽轉(zhuǎn)運(yùn)體PEPT1 的表達(dá)升高及ABCG2 的表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)了光動(dòng)力對(duì)胃癌的損傷。

總之，我們的研究初步表明，ABCG2 在膀胱癌細(xì)胞中的存在可能介導(dǎo)了放療的抵抗，ABCG2的小分子抑制劑及ABCG2 的鈣離子阻斷劑維拉帕米可能成為放療的增敏劑。

［1］Al-Dimassi S，Abou-Antoun T，El-Sibai M.Cancer cell resistance mechanisms:a mini review［J］.Clin Transl Oncol，2014，16(6):511

［2］Kang MK，Hur BI，Ko MH，et al.Potential identity of multi-potential cancer stem-like subpopulation after radiation of cultured brain glioma［J］.BMC Neurosci，2008，9(15):1471

［3］Bednar F，Simeone DM.Pancreatic cancer stem cells and relevance to cancer treatments［J］.J Cell Biochem，2009，107(1):40

［4］Xie J，Jin B，Li DW，et al.ABCG2 regulated by MAPK pathways is associated with cancer progression in laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Am J Cancer Res，2014，4(6):698

［5］Ishikawa T，Kajimoto Y，Sun W，et al.Role of Nrf2 in cancer photodynamic therapy:regulation of human ABC transporter ABCG2［J］.J Pharm Sci，2013，102(9):3058

［6］Hagiya Y，Endo Y，Yonemura Y，et al.Pivotal roles of peptide transporter PEPT1 and ATP-binding cassette(ABC) transporter ABCG2 in 5-aminolevulinic acid(ALA)-based photocytotoxicity of gastric cancer cells in vitro［J］.Photodiagnosis Photodyn Ther，2012，9(3):204