張靜 黃麗林 張曉輝 鐘毅 何泰龍 袁立燕 黃懷球

孢子絲菌病是孢子絲菌復(fù)合體所致的深部真菌病，其發(fā)病機制與機體免疫狀況和孢子絲菌毒力有關(guān)［1］。不同類型和強度的免疫反應(yīng)導致疾病的不同流行病學分布和臨床特征，因此，研究機體對孢子絲菌直接的免疫反應(yīng)是明確孢子絲菌病發(fā)病機制的關(guān)鍵。孢子絲菌入侵時，機體通過早期免疫細胞膜表面的模式識別受體等各種免疫識別受體對其進行識別及介導各種免疫應(yīng)答，但具體機制尚不明確。Toll樣（TLR）受體家族是眾多模式識別受體中重要的家族，已有研究表明，TLR4、TLR2參與了機體對孢子絲菌、白念珠菌、煙曲霉菌絲、馬爾尼菲青霉的免疫識別［2-4］。目前研究已證實，TLR2和TLR4參與機體對真菌的免疫識別，進一步激活胞內(nèi)信號分子，產(chǎn)生ROS和相關(guān)炎癥細胞因子直接或間接參與真菌免疫清除。不同的真菌誘發(fā)的免疫反應(yīng)類型及強度不同引起機體的組織病理改變亦不同［5］。本研究通過建立孢子絲菌BALB/c小鼠皮膚感染模型，檢測其感染皮膚TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表達水平及部位，探討TLR通路在孢子絲菌感染中的意義。

資料和方法

一、資料

1.菌株來源：孢子絲菌CMCC（F）D1a株由中國微生物菌種保藏中心提供。

2.實驗動物：60只雌性7～8周BALB/c小鼠由中山大學醫(yī)學院動物中心提供，體重20～25 g，合格證號SCXK粵2004-0011。

3.主要試劑和儀器：沙堡弱培養(yǎng)基（日本和光純藥株式會社）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基（日本和光純藥株式會社），生理氯化鈉液（北京恒安制藥有限公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（立陶宛MBI Fermentas公司），濾膜（英國Whatman公司），實時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國ABI公司），超微量紫外可見光分光光度計（中國ThermoFisher scientific公司）。

二、方法

1.孢子絲菌分生孢子懸液制備：將孢子絲菌CMCC（F）D1a株（菌絲相）轉(zhuǎn)種至SDA斜面培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)活化7 d，然后轉(zhuǎn)種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1周后有產(chǎn)孢。用槍頭將1 ml生理氯化鈉液注入長滿菌落的斜面，輕輕吹打，然后吸出至EP管。室溫下靜置20 min左右，待菌絲沉淀后，輕輕將上清液吸出至另一微量離心管。14 167×g離心5 min，去除上清液，加入2 ml生理氯化鈉液。顯微鏡下觀察，若有少量短菌絲可作為孢子計數(shù)，若短菌絲較多，可繼續(xù)使用濾膜（Whatman No.1）進一步過濾。用血細胞計數(shù)板調(diào)整菌懸液至1×107cfu/ml。將已配置菌懸液稀釋后接種于PDA平板，驗證菌懸液活力及濃度。

2.小鼠皮膚感染模型：將60只BALB/c小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組隨機分為6小組，即：接種前、接種后 6、12、24、48、96 h組，每小組5只小鼠，另設(shè)5只無處理空白對照組。在實驗組，每只小鼠背部皮下注射0.1 ml濃度為1×107cfu/ml的孢子絲菌懸液，對照組則皮下注射生理氯化鈉液。實驗組及對照組小鼠均在處理后 6、12、24、48、96 h 處死并取其注射部位附近皮膚組織。HE染色和PAS染色后觀察感染過程，組織培養(yǎng)出孢子絲菌即認為造模成功。

3.實時熒光定量PCR：獲取的皮膚組織用Trizol試劑根據(jù)說明書進行總RNA提取，采用紫外分光光度計評估其完整性并估算其產(chǎn)量。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。按照說明書采用ABI PRISM7000實時PCR嵌合熒光法，對TLR2和TLR4 mRNA進行相對定量分析，每個反應(yīng)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。實時PCR所用引物（表1）均由大連TaKaRa生物公司合成，內(nèi)參基因為GAPDH。

4.免疫組化分析：皮膚組織常規(guī)石蠟包埋，切片。以PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察TLR2及TLR4的表達。染色結(jié)果判定：染色強度依次為0分（無色），1分（淡黃色），2分（棕黃色），3分（棕褐色）；染色范圍以染色陽性細胞所占百分比表示，＜25%、25%～50%、51%～75%、＞75%分別判定為0、1、2、3分；染色強度和陽性細胞百分比的乘積為免疫組化的結(jié)果：0、1～2、3～4、6～9分別判定為無（-）、弱（+）、中等（++）、大量（+++）。

5.ELISA：各組小鼠留取的血液自然凝固20min，4℃885×g離心20 min，ELISA法檢測血清中促炎細胞因子IL-12、TNF-α含量，操作嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

三、統(tǒng)計分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料符合方差齊性采用t檢驗，組間用方差分析，等級資料采用秩和檢驗，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、小鼠皮膚組織病理

皮下注射孢子絲菌分生孢子和生理氯化鈉液96 h后，實驗組及對照組均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見皮損。但是切片HE染色顯示，實驗組有炎癥細胞浸潤，PAS染色可見酵母相真菌，而在對照組未見炎癥細胞浸潤及酵母相真菌。見圖1。實驗組皮膚組織可培養(yǎng)出孢子絲菌。

表1 實時熒光定量PCR所用引物

圖1 小鼠皮膚接種孢子絲菌分生孢子96 h后組織病理改變（×400） 1A、1C：對照組；1B、1D：實驗組。對照組皮膚無異常改變，PAS染色陰性；實驗組有明顯炎癥細胞浸潤，PAS染色可見酵母樣真菌（箭頭）

二、實時熒光定量PCR檢測小鼠皮膚TLR2和TLR4 mRNA表達水平

正常BALB/c小鼠低表達TLR2和TLR4 mRNA。實驗組TLR2 mRNA在6 h內(nèi)升高，24 h達高峰（P＜0.05），隨后逐漸下降，到96 h其表達與正常組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組TLR2 mRNA表達在生理氯化鈉液處理后6 h內(nèi)升高（P＜0.05），隨后逐漸下降，在96 h與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在各個時間點，實驗組的TLR2 mRNA水平均高于對照組（P＜0.05，圖2）；TLR4 mRNA表達在孢子絲菌處理6 h內(nèi)達高峰，隨后逐漸降低。在對照組，TLR4 mRNA表達在6 h達高峰（P＜0.05），在其他時間點與正常小鼠相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在各個時間點，TLR2 mRNA水平在實驗組均高于對照組（P＜0.05，圖3）。

三、免疫組化檢測小鼠皮膚TLR2和TLR4蛋白表達水平

圖2 孢子絲菌和生理氯化鈉液處理后不同時間小鼠皮膚TLR2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

正常小鼠皮膚不表達TLR2和TLR4蛋白（圖4、5）。對照組小鼠皮膚未見TLR2明顯表達，TLR4有弱表達。在孢子絲菌分生孢子組小鼠皮膚角質(zhì)形成細胞膜上及細胞質(zhì)可見TLR2中等量表達，TLR4較強表達。TLR2、TLR4在對照組小鼠真皮部位未見明顯表達；在孢子絲菌分生孢子組小鼠真皮巨噬細胞膜上及細胞質(zhì)可見TLR2較強表達，TLR4中等量表達。

四、ELISA檢測血清中細胞因子IL-12、TNF-α含量

實驗組血清中IL-12含量為29.25～31.17 ng/L，對照組為29.62～31.45 ng/L，兩組隨時間變化均無明顯升高趨勢，且各時間點兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗組血清中TNF-α表達水平為272.80～300.06 ng/L，生理氯化鈉液處理組為271.06～288.04 ng/L，兩組隨時間變化均無明顯變化（P＞0.05），各時間點TNF-α的含量在兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

討 論

圖3 孢子絲菌和生理氯化鈉液處理后不同時間小鼠皮膚TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖4 TLR2和TLR4在小鼠表皮的表達（免疫組化×400） 正常小鼠表皮TLR2、TLR4均未見明顯表達；生理氯化鈉液組小鼠表皮TLR2未見明顯表達，TLR4有弱表達；感染孢子絲菌分生孢子組小鼠皮膚TLR2在角質(zhì)形成細胞膜及胞質(zhì)中等量表達，TLR4大量表達

圖5 TLR2和TLR4在小鼠真皮的表達（免疫組化×400） 正常小鼠和生理氯化鈉液組小鼠真皮TLR2、TLR4均未見明顯表達；感染孢子絲菌分生孢子組小鼠真皮部位巨噬細胞膜上及細胞質(zhì)可見TLR2大量表達、TLR4中等量表達

孢子絲菌可通過皮膚傷口感染機體并激活皮膚早期免疫反應(yīng)系統(tǒng)，為了模仿人自然感染形成過程，通過皮下注射孢子絲菌分生孢子懸液建立動物皮膚感染模型。本研究結(jié)果顯示，孢子絲菌可誘導小鼠皮膚TLR2和TLR4表達，提示TLR2和TLR4均參與了孢子絲菌的免疫識別。Sassa等［6］發(fā)現(xiàn)，感染孢子絲菌的TLR4基因缺陷小鼠腹腔巨噬細胞在體外24 h后再次予孢子絲菌的脂類提取物刺激，結(jié)果促炎癥細胞因子TNF-α、NO和抗炎癥細胞因子IL-10均表達下調(diào)，NF-κB轉(zhuǎn)位到核內(nèi)低于對照組。我們的研究也證實，孢子絲菌感染時，TLR4參與皮膚免疫識別，同時發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4 mRNA表達均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，提示與胞內(nèi)信號激活后細胞因子反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。實驗組小鼠接種孢子絲菌后TLR2 mRNA皮膚表達在24 h達到高峰，TLR4 mRNA表達則在6 h達高峰，提示兩者在不同時間段發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，TLR4 mRNA表達水平高于TLR2 mRNA表達水平，提示在申克孢子絲菌早期免疫應(yīng)答中TLR4起更重要作用。TLR2通過誘導未成熟樹突細胞轉(zhuǎn)化為成熟樹突細胞并分泌IL-12 發(fā)揮作用［7］。TLR2 缺陷 BALB/c小鼠中，TLR4能夠代償TLR2這一功能，TLR4誘導成熟樹突細胞分泌 IL-6 卻比 TLR2 更顯著［8］。Schauber等［9］發(fā)現(xiàn)，皮膚損傷可以通過維生素D依賴的機制促進TLR2的表達，本研究對照組小鼠TLR2和TLR4 mRNA表達在6 h后開始升高，與皮膚針刺損傷6 h后TLR2和TLR4 mRNA表達有關(guān)，穿刺損傷引起的炎癥反應(yīng)輕微，以致TLR2和TLR4 mRNA表達很快降至正常水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，孢子絲菌誘導小鼠皮膚角質(zhì)形成細胞TLR2和TLR4的表達，TLR2主要在表皮上層表達，TLR4 則在表皮全層表達。Pivarcsi等［10］發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細胞可表達各種模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），包括 TLR2 和 TLR4，微生物刺激角質(zhì)形成細胞時，TLR通路可介導NF-κB、NO和各種炎癥細胞因子的表達。促炎細胞因子IL-12和TNF-α是免疫系統(tǒng)激活的產(chǎn)物，其在孢子絲菌的免疫清除中發(fā)揮作用［11-12］。我們進一步通過ELISA檢測TLR2和TLR4下游促炎細胞因子IL-12和TNF-α的分泌情況，發(fā)現(xiàn)與生理氯化鈉液對照組相比，實驗組在各時間點的IL-12和TNF-α含量變化均不明顯，兩組間比較均無統(tǒng)計學差異。這可能是機體處于早期免疫反應(yīng)階段，主要以局部的免疫細胞反應(yīng)為主，尚未形成系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，故血液中的細胞因子釋放量較少，反應(yīng)不出與對照組之間的差異。

孢子絲菌接種后真皮巨噬細胞可表達TLR2和TLR4。巨噬細胞通過吞噬和殺傷孢子發(fā)揮抗真菌感染第一道防線，TLR可介導巨噬細胞的吞噬功能［13］。TLR2 介導巨噬細胞對煙曲霉的識別和吞噬［14］，TLR4在巨噬細胞防御真菌中的重要作用［6］，本研究也證實皮膚巨噬細胞TLR4和TLR2的表達在真菌感染防御中起作用。可見，孢子絲菌感染時，小鼠皮膚角質(zhì)形成細胞和巨噬細胞共同表達TLR2和TLR4，發(fā)揮抗真菌免疫作用。

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