孫瑩 孫肅 孫靜

1.遼寧省腫瘤研究所，遼寧沈陽(yáng)110042；2.遼寧省職業(yè)病防治院，遼寧沈陽(yáng)110005

金雀異黃素對(duì)雌激素依賴靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用

孫瑩1孫肅2孫靜1

1.遼寧省腫瘤研究所，遼寧沈陽(yáng)110042；2.遼寧省職業(yè)病防治院，遼寧沈陽(yáng)110005

目的觀察金雀異黃素（genistein，GNT）對(duì)雌激素受體（estrogen receptor，ER）靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。方法采用不同濃度的金雀異黃素（5、10、20 ng/mL）+雌二醇（10 ng/mL）或雌二醇單獨(dú)處理乳腺癌細(xì)胞MCF7，36 h后收集細(xì)胞檢測(cè)金雀異黃素對(duì)雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，通過(guò)定量PCR技術(shù)檢測(cè)金雀異黃素對(duì)ER靶基因PDZK1和GREB1轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果隨著金雀異黃素濃度的增高，ER報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降，與之相一致，PDZK1和GREB1的轉(zhuǎn)錄水平也逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論金雀異黃素能夠與雌二醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞表面的ER，并拮抗ER調(diào)控的靶基因表達(dá)。

金雀異黃素；雌二醇；雌激素受體；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

植物中有各種抗炎抗腫瘤作用的活性物質(zhì)［1］，大豆異黃酮是已知的植物雌激素，在預(yù)防和治療腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和絕經(jīng)后綜合征等方面的作用已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可［2］。金雀異黃素化學(xué)名為4，5，7-三經(jīng)基異黃酮，性狀是淡黃色樹(shù)枝狀針晶粉末，熔點(diǎn)（mp）297～298℃，溶于常用的有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水，溶于稀堿中呈黃色。金雀異黃素（又稱染料木素）是來(lái)源于豆類植物和齒狀植物的異黃酮類化合物，可通過(guò)影響一系列的細(xì)胞信號(hào)通路，發(fā)揮廣泛的預(yù)防和治療腫瘤作用［3-5］。金雀異黃素是一種強(qiáng)力的酪氨酸蛋白激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，通過(guò)抑制以上兩種酶的活性，達(dá)到對(duì)癌基因的調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)多途徑抑制腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移［6］。金雀異黃素（Genistein）增加性激素結(jié)合球蛋白合成，從而降低激素生物利用度，降低雌激素依賴細(xì)胞增殖活性，減少激素相關(guān)腫瘤的發(fā)生。但金雀異黃素水溶性很低，直接服用不利于人體吸收［7］，能否降低雌激素的生物利用度，抑制雌激素調(diào)控的靶基因表達(dá)目前還不明確。金雀異黃素抗癌研究已經(jīng)成為全球熱點(diǎn)，并已取得很大進(jìn)展［8］。本文通過(guò)報(bào)道基因及實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)金雀異黃素能夠和雌二醇競(jìng)爭(zhēng)乳腺癌細(xì)胞表面的雌激素受體（ER），并抑制ER調(diào)控靶基因的表達(dá)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細(xì)胞系MCF7購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。雌二醇（純度99%）購(gòu)自北京四環(huán)制藥廠；金雀異黃素（純度98%）購(gòu)自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基及Real Mastermix（SYBR Green）購(gòu)自天根公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑為Roche Diagnostics公司產(chǎn)品；雙報(bào)告基因熒光素酶檢測(cè)試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為五組：?jiǎn)渭僁MEM培養(yǎng)基不加藥組；雌二醇組（10 ng/mL）；金雀異黃素5 ng/mL+雌二醇組；金雀異黃素10 ng/mL+雌二醇組；金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組。

1.2.2 報(bào)告基因檢測(cè)將乳腺癌細(xì)胞MCF7接種于24孔板，按“1.2.1”項(xiàng)下分組條件處理細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按照Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明將2.0 μg報(bào)告基因質(zhì)粒pTAL-SEAP-ERE和校正質(zhì)粒pSV-β-gal（10 ng）轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞按照雙報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性，每組3個(gè)復(fù)孔，每次數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.2.3 Real-time PCR將乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞接種到6孔板中，按“1.2.1”項(xiàng)下分組條件處理細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞加入1 mL Trizol，按照Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。采用LightCycler實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)（Roche公司產(chǎn)品）進(jìn)行Real-time PCR。Real-time PCR引物按照文獻(xiàn)合成［9-10］。GREB1上游引物：5'-CAAAGAATAACCTGTTGGCCCTGC-3'，下游引物：5'-CCAGTTGT-TGGCACTTCGG-3'；PDZK1上游引物：5'-AGAAATGGCCTCCACCTTCAAC-3'，下游引物5＇-ACGGGCCCTCTAGACTCGAG-3'。GAPDH引物購(gòu)自Takala公司。PDZK1和GREB1基因的擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性2 min；95°C變性10 s，60°C退火10 s，72°C延伸10 s，共45個(gè)循環(huán)；72°C延伸5 min。用GAPDH的定量值對(duì)待測(cè)基因的定量值進(jìn)行均一化，進(jìn)而得到待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金雀異黃素對(duì)ERE報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用

加入雌二醇后，ERE報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性較不加藥組提高約5倍，提示乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞表面有ER表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞能夠?qū)Υ萍に禺a(chǎn)生應(yīng)答；隨著金雀異黃素濃度的增高，ERE報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性逐漸下降，金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組和雌二醇組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明金雀異黃素能夠和雌二醇競(jìng)爭(zhēng)乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞表面的ER，并抑制雌二醇的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。見(jiàn)表1。

表1 金雀異黃素對(duì)ERE報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用（x±s，n=3）

2.2 金雀異黃素對(duì)ER靶基因PDZK1和GREB1轉(zhuǎn)錄的抑制作用

為了確定金雀異黃素是否影響ER靶基因的轉(zhuǎn)錄，本研究采用Real-time PCR法檢測(cè)了ER靶基因PDZK1和GREB1 mRNA水平。結(jié)果顯示，隨著金雀異黃素濃度的增高，PDZK1和GREB1的轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降，金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組和雌二醇組PDZK1和GREB1 mRNA水平差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），該結(jié)果和報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明金雀異黃素可以拮抗雌激素調(diào)控的靶基因表達(dá)。見(jiàn)表2。

表2 金雀異黃素對(duì)ER靶基因PDZK1、GREB1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用（x±s，n=3）

3 討論

金雀異黃素是來(lái)源于植物并有與雌激素相似結(jié)構(gòu)的植物雌激素（phytocstrogen），其雌激素的調(diào)節(jié)作用引起廣泛關(guān)注。目前植物雌激素作為激素替代藥物、抗癌藥物以及食品添加物和補(bǔ)充物應(yīng)用［11］。大豆異黃酮是大豆產(chǎn)生的天然植物雌激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和雌二醇非常相似，而生物學(xué)活性卻只有雌二醇的1/10萬(wàn)。近年研究證實(shí)，異黃酮的抗腫瘤效應(yīng)主要是通過(guò)兩種途徑完成的，一種是ER依賴性，一種是ER非依賴性。在ER依賴途徑中，異黃酮能夠和雌激素競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面的ER，進(jìn)而拮抗雌激素調(diào)控的靶基因轉(zhuǎn)錄。在ER非依賴途徑中，大豆異黃酮可以通過(guò)抑制酪氨酸蛋白激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)揮抗腫瘤作用。酪氨酸激酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶是細(xì)胞內(nèi)重要的功能酶，很多參與細(xì)胞增殖及DNA損傷修復(fù)的功能蛋白均是它們的作用底物，抑制酪氨酸激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，可以阻斷細(xì)胞的生長(zhǎng)激動(dòng)信號(hào)，造成DNA損傷，促使細(xì)胞走向凋亡［12-14］。

徐琳琳等［15］認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段的過(guò)程，其中既包括遺傳因素也涉及到非遺傳因素，如環(huán)境和飲食等。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，攝入高含量的豆制品和綠茶可影響腫瘤及其他慢性疾病的發(fā)展［16］。金雀異黃素是大豆異黃酮的有效成分之一，已有研究資料表明，金雀異黃素是酪氨酸蛋白激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的強(qiáng)效抑制劑，金雀異黃素是否具有ER依賴性的抗腫瘤效應(yīng)目前還不明確。雌激素在乳腺癌的起始和進(jìn)展過(guò)程中充當(dāng)重要角色，雌激素通過(guò)核受體超家族成員ER調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄而控制生理和病理過(guò)程。ER是配體依賴型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，它調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化許多方面的基因程序［17］。在研究金雀異黃素與人類健康的關(guān)系時(shí)，從細(xì)胞分子水平、動(dòng)物模型到人體實(shí)驗(yàn)、大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果存在較大的爭(zhēng)議，實(shí)驗(yàn)室中金雀異黃素用量通常遠(yuǎn)高于食物中的含量，且使用的種類、純度、用量，采用的細(xì)胞系以及其他實(shí)驗(yàn)條件等均不盡相同，缺乏統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，給金雀異黃素的研究工作和廣泛應(yīng)用帶來(lái)一定的困難。隨著對(duì)金雀異黃素功能性和營(yíng)養(yǎng)性的深入研究，其提取及精制工藝的不斷完善，金雀異黃素將會(huì)在醫(yī)藥、保健品、食品、飲料及其它行業(yè)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［18］。本文以ER表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MCF7作為研究對(duì)象，用不同濃度的金雀異黃素和雌二醇共同處理乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞，結(jié)果顯示，金雀異黃素可以拮抗雌二醇的激動(dòng)效應(yīng)，并且其競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)和金雀異黃素的濃度具有相關(guān)性。金雀異黃素20 ng/mL+雌二醇組與單純雌二醇組比較，PDZK1和GREB1基因的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明金雀異黃素和大豆異黃酮的其他組分一樣，具有ER依賴性及ER非依賴的雙重抑癌效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)為揭示金雀異黃素的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

［1］饒澄，黃顯.黃酮類化合物抗炎和抗腫瘤共同作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2010，22（6）：8-11.

［2］伍瑩，劉江華.金雀異黃素防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2007，27（6）：530-533.

［3］Farina HG，Pomies M，Alonso DF，et al.Antitumor and antiangiogenic activity of soy isoflavone genistein in mouse modelsofmelanomaandbreastcancer［J］.OncologyReports，2006，16（4）：885-891.

［4］王麗斌，王玉華.金雀異黃素抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2012，27（1）：96-100.

［5］逢曉云，沈金芳，貢沁燕.大豆異黃酮對(duì)大鼠血脂的影響及其體內(nèi)外抗氧化作用研究［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2008，13（1）：62-67.

［6］郭瑞霞，馮俊霞，賈會(huì)珍，等.金雀異黃酮-4＇-O糖苷的合成方法研究［J］.河南化工，2013，30（4）：36-38.

［7］馮淑瑩，李國(guó)明，侯瓊，等.金雀異黃素/殼聚糖微球的制備及其釋藥性能［J］.華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，45（5）：64-67.

［8］呂春秀.金雀異黃素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用癌癥雜志，2011，26（1）：102-104.

［9］Hnatyszyn HJ，Liu M，Hilger A，et al.Correlation of GREB1 mRNA with protein expression in breast cancer：validation of a novel GREB1 monoclonal antibody［J］.Breast Cancer Research and Treatment，2009，122（2）：371-380.

［10］Wang P，Wang JJ，Xiao Y，et al.Interaction with PDZK1 is required for expression of organic anion transporting protein 1A1 on the hepatocyte surface［J］.Journal of Biological Chemistry，2005，280（34）：30143-30149.

［11］Naciff JM，Jump ML，Torontali SM，et al.Gene expreasion profile induced by 17alpha ethynyl eatradiol，bisphenolA，and genistein in the developing female reproductive system of the rat［J］.Toxicol SCI，2002，68（1）：184-199.

［12］李欣，高金恒，陳國(guó)良.蛋白酪氨酸激酶抑制劑的研究發(fā)展［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（12）：1005-1012.

［13］Pavese JM，F(xiàn)armer RL，Bergan RC.Inhibition of cancer cell invasion and metastasis by genistein［J］.Cancer and Metastasis Reviews，2010，29（3）：465-482.

［14］韓磊，郭克建，周文平，等.Genistein對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化的作用［J］.世界華人消化雜志，2008，16（21）：2359-2363.

［15］徐琳琳，孫慶敏，羅璇，等.金雀異黃素通過(guò)調(diào)控miR-27a及其靶基因?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3生長(zhǎng)的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17（12）：1321-1326.

［16］Zhou JR，Yu LY，Mai ZM，et al.Combined inhibition of estrogen-dependent human breast carcinoma by soy and tea bioactive components in mice［J］.International Journal of Cancer，2004，108（1）：8-14.

［17］沈麗霞，牛建昭，王繼峰.應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)金雀異黃素對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞雌激素受體相關(guān)信號(hào)通路基因表達(dá)的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（2）：100-103.

［18］許銀燕，管靜.Genistein的生物學(xué)功能研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16（5）：735-737.

Regulating effcet of Genistein on target-gene transcription of estrogen dependent

SUN Ying1SUN Su2SUN Jing1
1.Liaoning Tumor Institute,Liaoning Province,Shenyang110042,China;2.Liaoning Occupational Disease Precaution Clinic,Liaoning Province,Shenyang110005,China

ObjectiveTo observe the transcription effect of genistein(GNT)on estrogen receptor(ER)target-gene.MethodsBreast cancer cells line MCF7 were treated with GNT of different concentration(5,10,20 ng/mL)+estradiol (10 ng/mL)or estradiol only.Then 36 hour later,cells were collected to detect the transcription effect of GNT on report gene of estrogen response element(ERE).Quantitative PCR was applied to evaluate the expression level of ER targetgene PDZK1 and GREB1 by GNT.ResultsThe transcription level of ER target-gene decreased gradually with the increasing of GNT concentration,and the expression level of PDZK1 and GREB1 reduced consistently with the ER transcription,the differences were statistical significance among different groups(P＜0.05).ConclusionGNT can depress expression of ER gene by competing ER of cell surface with estradiol.

Genistein;Estradiol;Estrogen receptor;Transcriptional control

R344+.13；R285.5

A

1673-7210（2015）02（a）-0012-03

2014-10-05本文編輯：程銘）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81372287）。