周婧倩， 欽 松， 馬亮亮， 楊 宇， 張 倉， 余伯陽*

(1. 中國藥科大學，江蘇南京211198;2. 南京圣和藥業(yè)有限公司，江蘇南京210038)

消癌平注射液是由蘿藦科植物通關藤Marsdenia tenacissima (Roxb.)Wight et Arn. 的干燥藤莖經(jīng)水提醇沉制成的中藥注射劑，臨床上常用作肺癌、肝癌、胃癌、食道癌的治療藥物。研究證實消癌平注射液有明顯的體外抗腫瘤細胞轉移作用［1］，但是尚未見對消癌平注射液的抗腫瘤轉移作用的物質基礎研究的報道。前期研究表明通關藤藥材主要組分為多糖類、酚酸類、甾體苷(元)類［2-4］。本實驗采用中壓制備色譜分離制備三大類組分并通過模擬腫瘤轉移的三個主要步驟:黏附、遷移、侵襲以研究消癌平注射液及其大類組分不同配比下對腫瘤細胞轉移的抑制作用及其對抗腫瘤細胞轉移的影響能力，為進一步研究消癌平注射液的抗腫瘤作用、探明其有效成分及其作用機制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 中壓制備色譜MPLC (上海利穗Dr FlashⅡ);Mettler AL104 型分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司);細胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司);酶標儀(美國Molecular Devices 公司);超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司);離心機80-2B (上海安亭科學儀器廠制造);倒置顯微鏡 (日本OLYMPUS XSZ-D2)。

1.2 主要藥物及試劑 消癌平注射液(南京圣和藥業(yè)有限公司提供，批號分別為201209051，201209101，201208310，201203211，201209071，201210221，201207031，201208231，201209271，201209311，201209281，201202271，201207091，201209171，201209151，201208311，201209042，201207231，201006201，201203151)，胎牛血清(GIBCO)，RPMI 1640 培養(yǎng)液(GIBCO)，0.25%胰蛋白酶(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);噻唑藍MTT (美國AMRESCO 公司);纖維連接蛋白FN (美國Calbiochem 公司);小牛血清白蛋白BSA(美國羅氏公司);人工重構基底膜材料Matrigel 膠(美國BD 公司)，結晶紫(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);4%多聚甲醛(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 細胞 人肺癌細胞系A549，人肝癌細胞系BEL-7402，購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 樣品制備 取消癌平注射液20 mL，經(jīng)MPLC洗脫程序為A (水)-B (甲醇):1 ～9 min 0%B;9 ～22 min 30%B;22 ～31 min 70% B;31 ～38 min 100% B。大類組分Ⅰ:收集0 ～9 min 的洗脫液;大類組分Ⅱ:收集9 ～22 min 的洗脫液;大類組分Ⅲ:收集22 ～31 min 的洗脫液。各部分樣品減壓回收溶劑，冷凍干燥后統(tǒng)計并計算各部分得率。根據(jù)消癌平注射液中大類組分原固有比例組合得到8組實驗藥物(見表1)。

2.2 MTT 法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的兩種細胞按6 ×104個/mL 的密度接種于96 孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。分別加入生藥質量濃度為2、4、8、16、32、64、128、256 mg/mL 的消癌平注射液，陰性對照組及空白組加入等體積的1640 培養(yǎng)液，每組設6 個復孔，置培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，每孔加入MTT 100 mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，加入DSMO 150 mL/孔，用酶標儀測定OD 值，測定波長570 nm，參比波長650 nm。同法測定3 種大類組分IC50。細胞增殖抑制率% = (1 -ODtreated/ODcontrol)×100%。

表1 消癌平注射液及其大類組分不同配比藥物編號Tab.1 Numbers of different compounds

2.3 細胞黏附能力的檢測 調整A549、BEL-7402細胞密度至1 ×106個/mL，與等體積藥液混合后，以每孔100 mL 加至已包被纖維連接蛋白并水化的96孔板中，每組設6 個復孔，孵育1.5 h，棄去未黏附的細胞，用PBS 沖洗1 遍，以MTT 法在酶標儀上測定OD 值，測定波長570 nm，參比波長650 nm。黏附抑制率% =(1-ODtreated/ODcontrol)× 100%。

2.4 細胞體外侵襲能力檢測 將Transwell 小室的上室面加入50 mL Matrigel 稀釋液，放置3 h 后，棄去殘液，每孔加入10 mg/mL BSA 50 mL，水化30 min。用1640 培養(yǎng)液調整A549、BEL-7402 細胞密度至1 ×106個/mL，將細胞懸液和藥液等體積混合。Transwell 的上室加入180 mL 混合懸液，下室加入完全培養(yǎng)液650 mL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。20 h后用棉簽擦去基質膠和上室內(nèi)的細胞，下表面用4%多聚甲醛固定，用0.1%結晶紫染色，使用倒置顯微鏡進行觀察和拍照。小室用10%醋酸100 mL 抽提脫色，在酶標儀上600 nm 測其OD 值。侵襲抑制率% = (1 -ODtreated/ODcontrol)×100%。

2.5 細胞遷移能力檢測 實驗方法與體外侵襲力的檢測相同，只是不在聚碳酸脂膜上鋪Matrigel膠，置培養(yǎng)箱中12 h 后取出。

2.6 統(tǒng)計學方法 應用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件分析。

3 結果

3.1 消癌平注射液及其大類組分對A549、BEL-7402 細胞增殖的影響 不同生藥質量濃度消癌平注射液處理A549、BEL-7402 細胞48 h 后，MTT 法測定OD 值，并計算IC50，結果顯示消癌平注射液對A549、BEL-7402 細胞有明顯的抑制作用，同法測定各大類組分IC50(見表2)。

表2 消癌平注射液及大類組分對A549、BEL-7402 細胞增殖影響Tab.2 Effects of Xiaoaiping Injection and its fractions on proliferation of A549 and BEL-7402

3.2 消癌平注射液及其大類組分不同配比組對A549、BEL-7402 細胞黏附能力的影響 生藥質量濃度為5 ～20 mg/mL 時，8 組藥物均抑制A549、BEL-7402 細胞的黏附，且兩種細胞對FN 的黏附抑制率隨質量濃度的增加而升高 (見圖1)。20 mg/mL 時，消癌平注射液及原固有比例組對A549細胞的最高黏附抑制率分別達到 (46.41 ±3.65)%、 (43.13 ±0.49)%，但3 ～8 號藥物對A549 的黏附抑制率均小于25%，與對照組比較均有顯著性差異。由兩組圖表可以看出，在2.5 mg/mL時，大類組分Ⅰ-糖類單用時幾乎無效;原固有比例組與對照組實驗結果無顯著性差異(P ＞0.05)，作用相當，并且作用效果均優(yōu)于兩組分合用及單組分用藥。

圖1 8 組藥物對A549 (A)、BEL-7402 (B)細胞黏附的影響Fig.1 Effects of eight kinds of tested drugs on adhesion of A549 cells (A)and BEL-7402 cells (B)

3.3 消癌平注射液及其大類組分不同配比對A549、BEL-7402 細胞體外侵襲力的影響 圖2 為用倒置顯微鏡拍攝的經(jīng)結晶紫染色的侵襲到Transwell 小室底部的A549、BEL-7402 細胞，隨著藥物質量濃度的增高，侵襲過基底膜的細胞數(shù)逐漸減少，穿過膜的細胞數(shù)量直觀的體現(xiàn)了1 ～8 號藥物在生藥質量濃度分別為2.5、5、10 mg/mL 時對A549、BEL-7402 細胞侵襲的抑制能力。10 mg/mL時，8 組藥物對A549 細胞的抑制率分別為80.76%、82.22%、55.65%、57.91%、59.70%、35.40%、45.49%、46.24%;對BEL-7402 細胞的抑制率分別為:88.68%、87.97%、62.83%、65.54%、69.57%、41.49%、46.23%、42.25%。實驗數(shù)據(jù)顯示，高質量濃度時，8 組藥物對兩種細胞的侵襲具有不同程度的抑制作用:原固有配比組高于兩兩配比組，更高于單組分組;低質量濃度時，各組藥物之間無顯著差異，隨著藥物質量濃度的增加兩種細胞的各組數(shù)據(jù)與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

圖2 8 組藥物對A549 (A)、BEL-7402 (B)細胞侵襲的影響Fig.2 Effects of eight kinds of tested drugs on cell invasion of A549 cells and BEL-7402 cells

3.4 消癌平注射液及其大類組分不同配比對A549、BEL-7402 細胞運動遷移的影響 8 組藥物對A549、BEL-7402 細胞的運動趨化的抑制力同樣具有劑量依賴性(見圖3)，在生藥質量濃度為15 mg/mL 時，兩種細胞的最高遷移抑制率大于50%。對照組與原固有比例組無顯著差異，其它各組與對照組比較具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

圖3 8 組藥物對A549 (A)、BEL-7402 (B)細胞遷移的影響Fig.3 Effects of eight kinds of tested drugs on migration of A549 cells (A)and BEL-7402 cells (B)

4 結論

消癌平注射液化學成分復雜，具有廣泛的藥理活性，特別是其抗腫瘤作用較為明顯，且不良反應輕微［5-7］。

本研究從20 批消癌平注射液的不同梯度洗脫液中分離得到三大類化學組分，經(jīng)HPLC-UV/ELSD 檢測大類組分Ⅰ、大類組分Ⅱ、大類組分Ⅲ為:糖類、酚酸類、甾體類［8-10］，各組得率分別為(59.68 ±1.61)%、(16.93 ±1.53)%、 (14.90 ±0.93)%，統(tǒng)計消癌平注射液中大類組分原固有配比為(59.68 ±0.62)∶(16.93 ±0.59)∶(4.90 ±0.36)，20 批制備樣品平均總得率為91.50 ±1.62%，說明制備樣品方法的穩(wěn)定性良好。

研究證實消癌平注射液及三大類組分能不同程度抑制人肺癌A549 細胞、人肝癌BEL-7402 細胞的增殖。本研究通過黏附［11］、遷移、侵襲［12-13］3個方面探索消癌平注射液及其大類組分不同配比組藥物(共計8 組藥物)可能的抗腫瘤轉移機制，實驗結果顯示不同藥物組對抗腫瘤轉移具有劑量與時間相關性，隨著劑量的增加，抑制率增大。綜上所述，8 組藥物中消癌平注射液組與3 種組分依據(jù)原固有比例配比組(2 號藥物)實驗結果無顯著性差異(P ＞0.05)，抑制作用相當，抑制作用優(yōu)于兩種藥物配比組，更優(yōu)于單組分組。因此，我們根據(jù)中效原理［14-15］中的聯(lián)合作用公式設計了一系列實驗以研究三大類組分間是否存在協(xié)同作用，已有實驗結果顯示消癌平注射液中的三大類組分中兩種組分聯(lián)合用藥時的合并指數(shù)CI 均小于1，初步說明消癌平注射液中的三大類組分在抗腫瘤作用方面具有協(xié)同作用。

本研究結果也體現(xiàn)了中藥多途徑、多靶點整合調節(jié)的作用特點。消癌平及大類組分不同配比組在腫瘤轉移過程中的細胞黏附、侵襲以及抗遷移均表現(xiàn)出抑制作用，其中抗侵襲作用的最高抑制率大于80%，推測抗侵襲作用是消癌平注射液發(fā)揮抗腫瘤細胞轉移的關鍵步驟，具體機制有待進一步研究。

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