李文婷， 趙鳳鳴， 戴紫函， 周 韜， 李沐涵， 吳勉華*

(1. 南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210023;2. 愛丁堡大學生物科學學院，英國EH9 3JR)

肝癌為常見的惡性腫瘤之一且在我國發(fā)病率較高，其病因迄今尚未闡明。肝癌目前以手術(shù)治療、放療、局部消融療法、化療等綜合治療，但整體預后仍不良?，F(xiàn)代研究資料表明中草藥白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、增強非特異性免疫和保護神經(jīng)系統(tǒng)的作用。近年來因其在惡性腫瘤和炎性疾病中的顯著效果［1］被廣泛應用于臨床，受到醫(yī)藥工作者的重視。實驗證明白花蛇舌草對多種腫瘤細胞具有抑制生長和誘導凋亡的作用，如人膠質(zhì)母細胞瘤U87 細胞［2］、多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226 細胞［3］、人乳腺癌MCF-7 細胞［4］、腹水瘤S180 細胞［5］等。李潔［6］等體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草處理小鼠血道轉(zhuǎn)移模型后，對腫瘤細胞血道轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性。劉智勤［7］等報道白花蛇舌草聯(lián)合氟尿嘧啶5-Fu 作用于H22 荷瘤小鼠后，調(diào)節(jié)荷瘤小鼠胃腸和免疫功能，起到減毒增效的功能。

白花蛇舌草注射液作用于體內(nèi)、體外均有良好的抗腫瘤效果，但其對肝癌的作用機制研究尚不明確。本實驗選擇人肝癌SMMC-7721 細胞作為研究對象，探討白花蛇舌草對人肝癌SMMC-7721 細胞增殖凋亡及Bcl-2/CytC 信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 白花蛇舌草注射液購自吉林省通化振國藥業(yè)有限公司，(國藥準字Z22022101，產(chǎn)品批號130201，規(guī)格為每支裝2 mL);注射用順鉑購自齊魯制藥(海南)有限公司(國藥準字H20073652，產(chǎn)品批號1A1A1306026B，規(guī)格10 mg);DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液均購自Gibco 公司;胰酶、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Biosharp 公司;磷酸鹽緩沖液 (PBS)購自Hyclone 公司;一抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、CytC、β-actin 均購自Cell Signaling 公司，羊抗兔IgG 二抗購自Santa 公司。MTT 用PBS 溶液配制成濃度是5 mg/mL，4 ℃避光保存于冰箱，1 周棄用。

1.2 方法

1.2.1 細胞株及細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株SMMC-7721 購自南京凱基生物公司。將SMMC-7721 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL 的青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞密度為1 ×105個/mL。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 噻唑藍還原法(MTT 法)檢測白花蛇舌草注射液對細胞增殖的影響 將SMMC-7721 細胞以每孔180 μL 接種于96 孔板中，加入白花蛇舌草注射液20 μL，終濃度分別為0 (空白對照)、25、50、100 μg/mL，陽性對照組加入順鉑20 μL，終濃度為4 μg/mL，每個藥物濃度組各設(shè)6 個復孔。置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件下細胞培養(yǎng)箱中孵育24、48 h 后加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，振蕩2 min 混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)試劑，每孔加DMSO 150 μL，吸棄試劑，加入DMSO 溶液150 μL，輕輕振蕩10 min，充分混勻后，放入酶標儀中，選取490 nm 波長測定每孔吸光度(OD)值。調(diào)零孔為200 μL DMEM 培養(yǎng)液。計算細胞增殖抑制率IR(%) =［1-(OD處理組-OD調(diào)零孔)/(OD空白對照組-OD調(diào)零孔)］×100%。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察結(jié)果 使用終濃度分別為0 (空白對照)、25、50、100 μg/mL 白花蛇舌草注射液及4 μg/mL順鉑作用于人肝癌SMMC-7721 細胞24 h 后，倒置顯微鏡下對每組SMMC-7721 細胞形態(tài)進行觀察。

1.2.4 透視電鏡觀察結(jié)果 取對數(shù)生長期細胞加入白花蛇舌草注射液，使其終濃度為100 μg/mL，空白組加入DMEM 培養(yǎng)液后，放置于37 ℃，體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，胰酶消化，1 000 r/min 離心10 min，去上清后沿離心管壁緩慢加入0.25%戊二醛固定。乙醇脫水后，采用LR White 包埋，切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后，觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.5 Western blot 法檢測蛋白表達 將4 組(0、25、50、100 μg/mL)白花蛇舌草注射液和1 組4 μg/mL 順鉑分別作用細胞24 h 后，低溫提取蛋白，蛋白定量，加入4 ×loading buffer，100 ℃變性5 min。采用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉置于搖床上室溫封閉1 h，一抗按照1 ∶1 000 濃度在4 ℃中孵育過夜，TBST 洗膜3 次，各10 min，二抗按照1 ∶3 000 濃度配置，搖床上室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min，滴入ECL 顯色劑，避光顯色1 min 后放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光，實驗重復3 次。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。樣本比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草注射液對SMMC-7721 作用 白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721 細胞24、48 h 后，細胞存活率在50、100 μg/mL 濃度下顯著下降。抑制率隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而升高，呈現(xiàn)劑量和時間依賴關(guān)系，見表1。白花蛇舌草注射液在50 μg/mL 和100 μg/mL 濃度時對SMMC-7721 細胞具有明顯的抑制作用(P ＜0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)在25 μg/mL 濃度下白花蛇舌草注射液組具有促腫瘤增殖趨勢。有文獻報道具有抗腫瘤作用中藥，在某些濃度下存在促進腫瘤生長作用。陳坤［8］等人報道一定體積分數(shù)的黃芪注射液具有促進人食管癌細胞珠TE-B 生長作用。本研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草亦存在此現(xiàn)象，表明中藥的使用上應注意其濃度，以充分發(fā)揮其抗腫瘤作用。

表1 白花蛇舌草注射液對人肝癌細胞增殖的影響(±s，n=3)

表1 白花蛇舌草注射液對人肝癌細胞增殖的影響(±s，n=3)

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05

組別 質(zhì)量濃度/(μg·mL -1 OD 值/(×10 -1抑制率/%24 h 48 h 24 h 48 h空白對照組 0 3.45 ±0.23 4.72 ±0.11 - -順鉑組 4 1.19 ±0.14* 0.88 ±0.15* 65.507 81.356白花蛇舌草注射液組 100 1.05 ±0.05* 0.97 ±0.13* 69.543 79.396白花蛇舌草注射液組 50 2.46 ±0.47* 2.59 ±0.13* 28.716 45.127白花蛇舌草注射液組 25 4.33 ±0.06* 6.25 ±0.21*))-25.526 -32.468

2.2 白花蛇舌草注射液對SMMC-7721 細胞形態(tài)的影響 不同劑量白花蛇舌草注射液作用后細胞形態(tài)存在差異，如圖1。

由圖1A 圖可見空白對照組SMMC-7721 細胞形態(tài)呈現(xiàn)多邊形或類三角型，緊密排列，胞質(zhì)較透明。不同濃度(25、50、100 μg/mL)的白花蛇舌草注射液處理后，隨著藥物濃度的增加，細胞密度明顯降低，數(shù)目減少，形態(tài)變得不規(guī)則。4 μg/mL 順鉑處理細胞后，細胞形態(tài)不規(guī)則，脫落，漂浮的細胞碎片增多。由圖1D 圖可見細胞出現(xiàn)萎縮、漂浮，細胞碎片增多，細胞膜邊緣出現(xiàn)空泡等凋亡形態(tài)改變。圖1E 細胞數(shù)目減少明顯，可見大量脫壁、漂浮的細胞。由圖可見100 μg/mL 白花蛇舌草注射液與4 μg/mL 順鉑作用于SMMC-7721 細胞后抑制細胞生長作用最為明顯。

2.3 白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721 細胞超微結(jié)構(gòu)變化由圖2A 圖可見，空白對照組細胞核較大，細胞核清晰，細胞器豐富，線粒體呈圓形或橢圓形，基質(zhì)豐富，細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。由圖2B 可見白花蛇舌草注射液劑量為100 μg/mL 時，微絨毛脫落，胞質(zhì)變性，出現(xiàn)空泡，細胞染色質(zhì)固縮，邊移，存在早期凋亡跡象。

2.4 白花蛇舌草注射液調(diào)控SMMC-7721 細胞Bcl-2/CytC 信號通路相關(guān)蛋白表達 Western blot 結(jié)果顯示由圖3 可見，100、50、25 μg/mL 白花蛇舌草注射液預處理細胞24 h，與對照組相比Bax、CytC、Caspase-3 蛋白表達逐漸加深，Bcl-2 蛋白表達逐漸減弱。Bcl-2/Bax 比值降低。其中100、50 μg/mL組效果最顯著。提示白花蛇舌草注射液能上調(diào)人肝癌SMMC-7721 細胞Bax 蛋白表達，下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達，降低Bcl-2/Bax 比值，釋放CytC，激活Caspase-3 蛋白的表達，誘導肝癌細胞凋亡，見表2。

3 討論

肝癌為常見的惡性腫瘤，其病程發(fā)展快，病人存活期短，預后多不良。我國屬肝癌的高發(fā)地區(qū)，肝癌死亡率約占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。目前對肝癌的治療以手術(shù)和化療為主的綜合治療，但大劑量化療藥物的毒副反應使得病人的生存質(zhì)量很差［9］。近年來，中醫(yī)藥抗腫瘤方面表現(xiàn)出的成效，使得人們將希望寄托在尋找副作用小且效果好的中藥，因此尋找治療肝癌的有效中成藥顯得十分迫切和有意義［10］。白花蛇舌在臨床廣泛使用，因其顯著療效，逐漸成為研究熱點。本實驗顯示50、100 μg/mL 的白花蛇舌草注射液表現(xiàn)出抑制人肝癌SMMC-7721 細胞增殖的能力，且隨著藥物濃度的升高和時間的延長，抑制作用逐漸增強，呈現(xiàn)出劑量時間依賴性。

圖1 各組SMMC-7721 細胞24 h 后形態(tài)學的變化(×400)

圖2 電鏡下觀察各組人肝癌細胞超微結(jié)構(gòu)變化

圖3 各組Bax，Bcl-2，Caspase-3 和CytC 蛋白表達水平

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h 后Bax、Bcl-2、Caspase-3和CytC 蛋白表達的影響(±s，n=3)

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h 后Bax、Bcl-2、Caspase-3和CytC 蛋白表達的影響(±s，n=3)

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05

組別 質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)Bax/β-actin Bcl-2/β-actin Caspase-3/β-actin Cyt-c/β-actin空白對照組0 0.35±0.03 0.22±0.02 0.07±0.01 0.12±0.04白花蛇舌草注射液組 100 0.56±0.02* 0.04±0.03* 0.17±0.02* 0.52±0.02*白花蛇舌草注射液組 50 0.48±0.03* 0.11±0.02* 0.09±0.02* 0.33±0.03*白花蛇舌草注射液組 25 0.34±0.04* 0.20±0.04* 0.22±0.04* 0.51±0.02*順鉑組 4 0.75±0.02* 0.18±0.04* 0.18±0.02* 0.42±0.03*

多數(shù)抗腫瘤藥物以抑制腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。形態(tài)學的改變可以直觀發(fā)現(xiàn)藥物處理后腫瘤細胞的變化［11］，本實驗中白花蛇舌草注射液處理SMMC-7721 細胞后細胞出現(xiàn)萎縮、碎片、小氣泡等凋亡形態(tài)改變，且存在劑量時間依賴性。透射電鏡下可見白花蛇舌草注射液100 μg/mL 時，細胞出現(xiàn)微絨毛脫落，胞質(zhì)變性，空泡，染色質(zhì)固縮邊移等早期凋亡跡象。本研究結(jié)果提示白花蛇舌草注射液可以通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導其凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

細胞凋亡的途徑主要有兩條:外部途徑稱死亡受體通路，內(nèi)部途徑稱線粒體通路，是以線粒體為核心介導細胞凋亡。線粒體信號通路調(diào)控細胞凋亡的作用十分明顯［12］。線粒體作為第二主要功能的細胞器，參與細胞能量代謝并通過呼吸鏈作用生成ATP，與DNA 損傷、細胞衰老、細胞死亡等有關(guān)［13］。Bcl-2 家族在線粒體凋亡途徑的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Bcl-2 家族包括以Bcl-2、Bcl-xL 為代表的抑制凋亡蛋白和以Bax、Bim 為代表的促進凋亡蛋白。這兩類相反的蛋白質(zhì)相互作用，可通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)信號傳遞系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細胞凋亡［14］。Bcl-2 表達量減少，Bax 表達量增高，，則Bcl-2/ Bax 比值降低，，則細胞容易發(fā)生凋亡。目前，Bcl-2 家族成員凋亡的機制可能有:(1)Bax 可以破壞線粒體膜，引起細胞色素C (Cytochrome C，CytC)的釋放，CytC 與凋亡蛋白酶活化因子(Apoptotic protease-activating factor，Apaf-1)結(jié)合成為多聚復合體從而激活Caspase-9，進一步強化了Caspase 級聯(lián)反應，激活下游的Caspase-3，最終導致細胞凋亡［15］，而在細胞凋亡時Bcl-2的作用則與之相反; (2)在Bax 家族中，有抗凋亡蛋白，如:Bcl-2、Bcl-xL 與Bax 和Bcl-xL 與Bak 相互作用后可阻止Bax 或Bak 發(fā)生構(gòu)象改變抑或阻止它們的寡聚化作用抑或阻止它們插入線粒體外膜，從而抑制細胞凋亡。線粒體凋亡通路在細胞凋亡中的作用至關(guān)重要，因此選擇此通路進行研究。本研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721細胞24 h 后可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2 的表達，Bcl-2/Bax 比值降低，釋放CytC 蛋白，最終激活Caspase-3 蛋白，從而誘導肝癌細胞凋亡，發(fā)揮體外抗腫瘤作用。

綜上所述，白花蛇舌草注射液對人肝癌SMMC-7721 細胞有抑制增殖、誘導凋亡的作用。其作用機制可能與其調(diào)控Bcl-2/Cytc 線粒體凋亡信號通路相關(guān)。

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