張美玲， 遲鐵錚， 單英俏， 姜麗嬌， 于 野， 貢濟(jì)宇*， 蔡廣知*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117；2.吉林市人民醫(yī)院，吉林吉林132001）

茺蔚子藥材儲(chǔ)藏過程中水蘇堿變化的影響因素分析

張美玲1， 遲鐵錚2， 單英俏1， 姜麗嬌1， 于 野1， 貢濟(jì)宇1*， 蔡廣知1*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117；2.吉林市人民醫(yī)院，吉林吉林132001）

目的以水蘇堿為指標(biāo)來考察影響茺蔚子藥材儲(chǔ)藏過程中水蘇堿含有量的因素及其變化趨勢。方法采用HPLC-ELSD法測定不同產(chǎn)地茺蔚子中水蘇堿，選用以氨基鍵合聚合物為填充劑的色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%醋酸溶液 （84∶16）；體積流量為1.0 mL/min，柱溫是35℃，蒸發(fā)光閃射檢測器?？疾鞙囟?、光照和時(shí)間對茺蔚子中水蘇堿的影響。結(jié)果方法平均回收率為98.3%，RSD=1.1%。不同產(chǎn)地的茺蔚子藥材中水蘇堿的含有量為2.19～3.13 mg/g；溫度對鹽酸水蘇堿的含有量無影響；光照儲(chǔ)存7個(gè)月后藥材中水蘇堿的含有量降低44.34%；儲(chǔ)存24個(gè)月藥材中水蘇堿的含有量下降18.83%。結(jié)論建立了茺蔚子藥材的成分定量測定方法，填補(bǔ)了藥材標(biāo)準(zhǔn)的空缺；光照條件下，茺蔚子藥材中水蘇堿含有量明顯下降，水蘇堿見光易降解，故茺蔚子藥材、飲片及其相關(guān)制劑在儲(chǔ)存或生產(chǎn)過程中均需要避光保存。盡量縮短藥材周轉(zhuǎn)期。

茺蔚子；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法；鹽酸水蘇堿；影響因素

茺蔚子為唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的干燥成熟果實(shí)［1］，具有活血調(diào)經(jīng)，清肝明目的功效［2］，為常用的婦科用中藥，全國大部分地區(qū)均有分布。含益母草寧堿、水蘇堿及脂肪油［3］，油酸及亞麻酸占油總量的84.84%，另含維生素A樣物質(zhì)［4］。2010年版 《中國藥典》中茺蔚子藥材標(biāo)準(zhǔn)無成分定量測定項(xiàng)，水蘇堿是茺蔚子中的主要活性成分之一，本實(shí)驗(yàn)擬建立茺蔚子中水蘇堿的HPLC-ELSD定量測定法，并對藥材中水蘇堿的影響因素及變化趨勢進(jìn)行分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀，SEDEX 55蒸發(fā)光散射檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器，安捷倫液相色譜工作站，Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；超聲波提取器（昆山禾創(chuàng)超聲儀有限公司）；AL204型萬分之一電子天平 （瑞士），AB135-S型十萬分之一電子天平（瑞士）。

1.2 試藥 鹽酸水蘇堿對照品 （批號110712-201010，購于中國食品藥品檢定研究院）；藥材采自全國各地；乙腈為色譜純，水為超純水；醋酸為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸水蘇堿對照品4.87 mg，置10 mL棕色量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取茺蔚子藥材粉末 （過三號篩）約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 氨基鍵合聚合物為填充劑的Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%醋酸溶液 （84∶16）；體積流量1 mL/min；柱溫35℃；SEDEX 55蒸發(fā)光散射檢測器 （漂移管溫度35℃，壓力為2.2 bar），進(jìn)樣量為5μL。理論塔板數(shù)按鹽酸水蘇堿計(jì)應(yīng)不低于6 000。對照品和供試品色譜圖見圖1和圖2。

圖1 鹽酸水蘇堿對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograMof stachydrine reference substance

圖2 茺蔚子色譜圖Fig.2 HPLC chromatograMof Leonuri Fructus

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述鹽酸水蘇堿對照品溶液 （每1 mL含對照品0.487 mg）1、3、5、7、9μL，注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）取對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值取對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程 y= 1.550 3x+2.149 5，r=0.999 9，表明鹽酸水蘇堿在0.487～4.383μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一鹽酸水蘇堿對照品溶液及供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5μL，測得鹽酸水蘇堿峰面積的RSD分別為1.2%、1.9%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批茺蔚子藥材6份，精密稱定，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，測得水蘇堿RSD為1.7%，平均含有量為2.62 mg/g，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液及對照品溶液各 5μL，分別在 0、2、4、8、12、24 h注進(jìn)樣測定，測得鹽酸水蘇堿峰面積的RSD分別為1.0%、1.5%，表明鹽酸水蘇堿對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的樣品6份，每份約1.5 g，置錐形瓶中，分別精密加入鹽酸水蘇堿對照品適量，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算回收率，結(jié)果鹽酸水蘇堿的平均回收率為98.3%，RSD為1.1%，說明本方法準(zhǔn)確度良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.5 樣品測定 取16份不同產(chǎn)地的茺蔚子藥材，按 “2.2”項(xiàng)下方法各平行制備兩份供試品溶液，按 “2.3”項(xiàng)下條件測定，記錄水蘇堿峰面積并計(jì)算，結(jié)果見表2。

2.6 影響因素考察

2.6.1 溫度控制 取茺蔚子3批每批9份樣品（每份100 g，置白色透明玻璃瓶），分別放于（15±1）℃、 （25±1）℃和 （35±1）℃恒溫箱中，每批每箱3份，用黑色不透光的紙包裹，每個(gè)月取適量樣品，按上述方法制備樣品溶液并測定水蘇堿量。

表2 不同產(chǎn)地茺蔚子藥材中鹽酸水蘇堿的測定Tab.2 DeterMination of the content of stachydrine nydro chloride in Leonuri Fructus froMdifferen t grow ing areas

2.6.2 光照控制 取茺蔚子3批每批6份樣品（每份100 g，置白色透明玻璃瓶），放于留樣室同一地點(diǎn)的樣品架，每批次取3份，避光保存 （黑色遮光紙包裹），另9瓶見光保存 （白色透明玻璃瓶），每月取上述條件儲(chǔ)存的樣品適量，按上述方法制備樣品溶液并測定水蘇堿量。

2.6.3 儲(chǔ)存時(shí)間考察 取茺蔚子3批每批3份樣品，25℃避光放置 （黑色遮光紙包裹），定期取上述條件儲(chǔ)存樣品適量，按上述方法制備樣品溶液并測定水蘇堿量。

2.7 影響因素考察結(jié)果

2.7.1 溫度對水蘇堿的影響 在 （15±1）℃、（25±1）℃ 和 （35±1）℃條件下，儲(chǔ)存7個(gè)月后茺蔚子中水蘇堿平均含有量分別下降 2.30%、2.30%和2.60%，說明溫度對藥材中水蘇堿的含有量影響較小。結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對茺蔚子藥材中鹽酸水蘇堿的影響Fig.3 Effect of teMperature on the contents of hydrochloric stachydrine in Leonuri Fructus medicinalmaterials

2.7.2 光照對水蘇堿的影響 光照對茺蔚子中水蘇堿的含有量有顯著影響，避光保存7個(gè)月，3批產(chǎn)品中水蘇堿的平均含有量為3.22 mg/g，見光保存，水蘇堿的平均含有量為1.79 mg/g，含有量降低44.34%，見光降解為水蘇堿含有量下降的主要原因。結(jié)果如圖4。

圖4 光照對茺蔚子中水蘇堿的影響Fig.4 Effect of light on the contents of hydrochloric stachydrine in Leonuri Fructus medicinalmaterials

2.7.3 儲(chǔ)存時(shí)間考察結(jié)果 隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長，茺蔚子中水蘇堿的含有量逐步減少，到24個(gè)月時(shí)，水蘇堿含有量下降18.83%。結(jié)果見表3。

表3 儲(chǔ)存時(shí)間對茺蔚子中水蘇堿的影響Tab.3 E ffect of storage time on the content of of hydroch loric stachydrine in Leonuri Fructus medicinalmaterials

3 討論

《中國藥典》2010年版中茺蔚子藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只作了定性鑒別規(guī)定，沒有成分定量測定的具體標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)建立了茺蔚子藥材中水蘇堿的HPLC-ELSD測定方法，水蘇堿屬于季銨堿，最大吸收波長192 nm也僅有微弱吸收，使用紫外檢測器有信號響應(yīng)值小、基線噪音大、基線不易穩(wěn)定等因素影響測定結(jié)果，蒸發(fā)光散射檢測器能克服上述缺點(diǎn)［5-9］，所以采用通用型檢測器蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測。

實(shí)驗(yàn)參數(shù)及條件的考察。供試品溶液的制備時(shí)，曾比較乙醇、70%乙醇和鹽酸甲醇3種溶劑的提取效果［10-12］，提取的完全程度70%乙醇 ＞乙醇＞鹽酸甲醇；提取方法考察了加熱回流法和超聲提取法，兩法提取效果沒有差異，故選擇簡便、省時(shí)的超聲提取法。曾考察 《中國藥典》2010年版益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量測定的色譜條件，色譜柱選用丙烯酰胺鍵合硅膠（Venusil HILIC4.6 mm×250 mm）作為填充劑［1］，結(jié)果表明，該類色譜柱的基線噪音較高，無法達(dá)到定量要求。后采用氨基鍵合聚合物（Asahipak NH2P50 4E 4.6 mm×250 mm）作為填充劑，結(jié)果表明，基線噪音低，重復(fù)性好，能夠滿足定量要求，故選擇氨基鍵合聚合物為填充劑的色譜柱進(jìn)行測定。經(jīng)比較乙腈-0.2%磷酸溶液 （80∶20）與乙腈-0.2%磷酸溶液（84∶16）兩種流動(dòng)相，結(jié)果乙腈-0.2%磷酸溶液（84∶16）作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰分離度高，無拖尾，陰性無干擾，因此選擇乙腈-0.2%磷酸溶液（84∶16）作為流動(dòng)相。

不同產(chǎn)地的茺蔚子中水蘇堿的含有量存在較大差異，其中遼寧省大洼縣所產(chǎn)茺蔚子中水蘇堿的含有量最高，16份不同產(chǎn)地的茺蔚子中水蘇堿的平均含有量為2.63 mg/g，乘以系數(shù)0.8，水蘇堿的量為2.10 mg/g，可作為茺蔚子藥材質(zhì)量評價(jià)的參考標(biāo)準(zhǔn)。

茺蔚子中水蘇堿含有量的影響因素結(jié)果顯示水蘇堿見光易降解［13-14］，故茺蔚子藥材儲(chǔ)藏過程中應(yīng)常溫、避光保存，保存期應(yīng)控制在24個(gè)月內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)對于指導(dǎo)茺蔚子藥材及其制劑產(chǎn)品的規(guī)范化生產(chǎn)及安全有效使用具有現(xiàn)實(shí)意義。

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Influencing factors in the change of stachydrine hydrochloride in Leonuri Fructus during storage

ZHANGMei-ling1， CHITie-zheng2， SHAN Ying-qiao1， JIANG Li-jiao1， YU Ye1， GONG Ji-yu1*，
CAIGuang-zhi1*
（1.Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.Jilin City People's Hospital，Jilin 132001，China）

Fructus Leonuri；HPLC-ELSD；stachydrine hydrochloride；influencing factors

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1056-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.028

2014-12-29

吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目 （20130338SC）

張美玲（1990—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幓钚晕镔|(zhì)。E-mail：jlseven-fairy@163.com

*通信作者：貢濟(jì)宇 （1960—），女，教授，研究方向?yàn)樗幬锓治觥el：（0431）86172207，E-mail：gjy0431@126.com蔡廣知 （1977—），男，講師，研究方向?yàn)橹兴庤b定及質(zhì)量分析。Tel：13159751573，E-mail：80188429@qq.com