王士勇+楊月春+鄭軍軍+劉宗岳+方大雨+楊福合??

摘要：為了觀察秋水仙胺（demecolcine，DEME）誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞的顯核效果，從吉林省長(zhǎng)春市某屠宰場(chǎng)收集牛卵巢后采用抽吸法獲取卵泡液，在體視顯微鏡下選擇卵丘完整、胞質(zhì)均勻的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），微滴法體外成熟（invitromature，IVM）培養(yǎng)19～22h，在0.3%透明質(zhì)酸酶中旋渦振蕩去除卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，挑選排出第一極體的卵母細(xì)胞隨機(jī)分組，分別進(jìn)行DEME濃度和作用時(shí)間誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞顯核的研究。結(jié)果表明，DEME處理60、90、120min組間顯核率差異不顯著（P>0.05），但是60、120min組的顯核率顯著高于DEME處理30min組（P<0.05）。當(dāng)DEME濃度為0.5μg/mL時(shí)，顯核率最高，為78.9%，顯著高于0.3、0.4μg/mL組（P<0.05），但是與0.6μg/mL組差異不顯著（P>0.05）。牛的COCs經(jīng)IVM培養(yǎng)19、20、21、22h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)22h組顯核率最高，顯著高于培養(yǎng)19h組（P<0.05），但是與培養(yǎng)20、21h組差異不顯著（P>0.05）?？梢娕Ｂ涯讣?xì)胞經(jīng)IVM培養(yǎng)20～22h后，用0.5μg/mLDEME處理60min可以有效誘導(dǎo)其顯核。

關(guān)鍵詞：地美可辛；牛；卵母細(xì)胞；體外成熟；化學(xué)輔助去核

中圖分類號(hào)：S823.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0228-03

自1997年第1只體細(xì)胞核移植動(dòng)物——“多莉”誕生[1]以來，體細(xì)胞核移植技術(shù)已經(jīng)發(fā)展十幾年的時(shí)間，由于其在核質(zhì)互作、瀕危動(dòng)物保護(hù)方面具有深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景[2]，同時(shí)可利用的大量瀕危動(dòng)物卵母細(xì)胞通常很難獲得，而屠宰場(chǎng)屠宰后的母牛卵巢方便獲取且易獲得大量卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)，利用其進(jìn)行種間體細(xì)胞核移植技術(shù)研究在當(dāng)前較廣泛。但是包括牛在內(nèi)的家畜卵母細(xì)胞不像鼠科動(dòng)物的卵母細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下可以直接看到細(xì)胞核[3]，所以通常去核時(shí)采用盲吸法[4]、熒光輔助法[5]或秋水仙胺（demecolcine，DEME）誘導(dǎo)顯核法[6]。利用盲吸法去核時(shí)為了提高去核效率通常要去除較大體積的胞質(zhì)，之后還需要在紫外光下照射以確定去核成功率，這會(huì)給受體胞質(zhì)造成不可逆的傷害，而熒光輔助法去核法同樣需要對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行紫外光照射，具有同樣或更重的傷害[7]。DEME誘導(dǎo)顯核法利用DEME對(duì)受體卵母細(xì)胞處理后能夠破壞其微管穩(wěn)定性、干擾染色體的正常分離和紡錘體的功能促進(jìn)核內(nèi)所有染色質(zhì)聚集在胞質(zhì)表面形成一個(gè)突起，去核時(shí)僅去除極少量的胞質(zhì)即可達(dá)到完全去核的目的，去核后在沒有DEME的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)即可恢復(fù)微管的聚集[8]。本試驗(yàn)就牛卵母細(xì)胞經(jīng)過微滴法體外成熟（invitromature，IVM）不同時(shí)間后用DEME處理對(duì)其顯核情況進(jìn)行研究，旨在確定DEME誘導(dǎo)去核時(shí)的適宜濃度和處理時(shí)間，以滿足體細(xì)胞核移植研究需要，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

DEME和丙酮酸鈉購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司，人絨毛促性腺激素（hCG）和孕馬血清促性腺激素（PMSG）購(gòu)自浙江省寧波市三生藥業(yè)有限公司，其余試劑均購(gòu)自生命科技公司。

1.2卵巢的獲取及卵母細(xì)胞的收集

卵巢采集于吉林省長(zhǎng)春市某屠宰場(chǎng)，母牛屠宰后立即采取卵巢將其放入含有雙抗的25～35℃生理鹽水中，8h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。將收集的卵巢剪去附著的系膜和輸卵管，用滅菌生理鹽水清洗3次后，用帶有16號(hào)針頭的10mL注射器抽吸法收集卵泡液，在體視顯微鏡下選擇卵丘完整、胞質(zhì)均勻的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocyte-complexes，COCs）用含5%FBS的PBS洗凈。

1.3卵母細(xì)胞體外成熟

將挑選好的COCs用成熟液洗3次，然后移入平衡2h以上的微滴成熟液中，放入38.5℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液組成為90%M199+10%FBS+10μg/mLPMSG+10μg/mLhCG+0.33mmol/L丙酮酸鈉，成熟培養(yǎng)19～22h后置于含3mg/mL透明質(zhì)酸酶的DPBS中，渦旋混合器振蕩去掉卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，檢查成熟情況，以體視顯微鏡下觀察到卵丘細(xì)胞擴(kuò)展（圖1）及排出第一極體（圖2）視為成熟。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)一：IVM培養(yǎng)21h后，挑選成熟的卵母細(xì)胞隨機(jī)分組，洗凈后放入含0.4μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培養(yǎng)液中，在38.5℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30、60、90、120min，在體視顯微鏡下觀察顯核情況（圖3）。

試驗(yàn)二：IVM培養(yǎng)21h后，挑選成熟的卵母細(xì)胞隨機(jī)分組，洗凈后放入含0.3、0.4、0.5、0.6μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培養(yǎng)液中，在38.5℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min，在體視顯微鏡下觀察顯核情況（圖3）。

試驗(yàn)三：IVM培養(yǎng)19～22h后，挑選成熟的卵母細(xì)胞洗凈后放入含0.5μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培養(yǎng)液中，在38.5℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min，在體視顯微鏡下觀察顯核情況（圖3）。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，差異顯著標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。

2結(jié)果與分析

2.1DEME處理時(shí)間對(duì)牛卵母細(xì)胞顯核效果的影響

牛卵母細(xì)胞經(jīng)0.4μg/mLDEME處理不同時(shí)間之后，顯核結(jié)果如表1所示，60、90、120min組間顯核率差異不顯著（P>0.05），但是60、120min組的顯核率顯著高于30min組（P<0.05）。

2.2DEME濃度對(duì)牛卵母細(xì)胞顯核效果的影響

牛卵母細(xì)胞經(jīng)不同濃度DEME處理60min之后，顯核結(jié)果如表2所示，當(dāng)DEME的濃度為0.5μg/mL時(shí)，顯核率最高，為78.9%，顯著高于0.3、0.4μg/mL組（P<0.05），但是與0.6μg/mL組差異不顯著（P>0.05）。endprint

2.3IVM時(shí)間對(duì)DEME誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞顯核效果的影響

牛COCs經(jīng)IVM不同時(shí)間之后，DEME誘導(dǎo)顯核結(jié)果如表3所示，其中19h組顯核率最低，且顯著低于21、22h組（P<0.05），但是與20h組差異不顯著（P>0.05）；22h組顯核率最高，與20、21h組差異不顯著（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

體細(xì)胞核移植技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵步驟就是受體卵母細(xì)胞的去核，去核的成功率直接影響核移植的整體效率，傳統(tǒng)的盲吸法對(duì)操作者的技術(shù)熟練水平要求較高，并且去除胞質(zhì)較多，不利于核移植胚胎后期的發(fā)育。利用DEME進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)去核不僅去除胞質(zhì)量較少，而且化學(xué)誘導(dǎo)劑作用時(shí)間較短，所以對(duì)核移植胚胎的后期發(fā)育并無明顯不良影響，近年來成為采用較多的一種主流方法。應(yīng)用DEME誘導(dǎo)去核通常采用2種方式：一種是將激活處理后的卵母細(xì)胞在一定濃度的DEME中處理相應(yīng)的時(shí)間，使同源染色體隨著第二極體排出胞質(zhì)，這種方式在小鼠[9]、山羊[9]、兔[10]、牛[11]上都有研究報(bào)道；另一種是將減數(shù)第二次分裂中期卵母細(xì)胞經(jīng)過DEME處理后，染色質(zhì)在卵母細(xì)胞胞質(zhì)表面形成一個(gè)包狀的突起，在顯微鏡下利用顯微操作去掉突起，同樣可以達(dá)到去核的目的，主要應(yīng)用在豬[6]、牛[12]等家畜方面。

DEME誘導(dǎo)去核的方法在不同動(dòng)物和不同試驗(yàn)體系下所采用的濃度及作用時(shí)間各不相同，Russell等報(bào)道，在牛上用DEME誘導(dǎo)去核時(shí)采用0.6μg/mL濃度處理90min較好[7]；Meng等采用0.4μg/mL濃度處理30～40min較好[3]，而本研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.5μg/mL時(shí)顯核率最高，且顯著高于0.4μg/mL組（P<0.05），這與王強(qiáng)等在小鼠上的研究結(jié)果[13]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，有些在前段時(shí)間沒有胞質(zhì)突起的在后來會(huì)出現(xiàn)胞質(zhì)突起，所以筆者認(rèn)為化學(xué)誘導(dǎo)去核作為一種輔助的手段在實(shí)際應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)各自的試驗(yàn)條件探索適宜體系，一般進(jìn)行體細(xì)胞核移植研究時(shí)都會(huì)根據(jù)受體卵母細(xì)胞數(shù)量而進(jìn)行多批次的去核操作，這樣就可以分別在30、60、90min等時(shí)間點(diǎn)（或根據(jù)試驗(yàn)進(jìn)度）多次挑選具有胞質(zhì)突起的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核操作。

由于卵母細(xì)胞的細(xì)胞核位置會(huì)隨著IVM時(shí)間的延長(zhǎng)而遠(yuǎn)離第一極體[14]，所以筆者研究了IVM時(shí)間對(duì)DEME誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞顯核效果的影響，結(jié)果顯示22h組顯核率最高，但是與20、21h組差異不顯著（P>0.05），說明在牛卵母細(xì)胞IVM20～22h這段時(shí)間里進(jìn)行DEME處理效果較適宜，同時(shí)在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DEME誘導(dǎo)的胞質(zhì)突起距離第一極體較遠(yuǎn)的概率增高，這與李裕強(qiáng)等的報(bào)道[14-15]一致。

參考文獻(xiàn)：

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[11]王玉涵，朱玉霞，尹多，等.化學(xué)輔助去核法對(duì)延邊黃牛卵母細(xì)胞去核率及其重構(gòu)胚發(fā)育率的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（2）：340-344.

[12]SongK，HyunSH，ShinT，etal.Post-activationtreatmentwithdemecolcineimprovesdevelopmentofsomaticcellnucleartransferembryosinpigsbymodifyingtheremodelingofdonornuclei[J].MolecularReproductionandDevelopment，2009，76（7）：611-619.

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[14]李裕強(qiáng)，張琇，安志興，等.牛卵母細(xì)胞的去核與激活[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，32（11）：6-10.

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2.3IVM時(shí)間對(duì)DEME誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞顯核效果的影響

牛COCs經(jīng)IVM不同時(shí)間之后，DEME誘導(dǎo)顯核結(jié)果如表3所示，其中19h組顯核率最低，且顯著低于21、22h組（P<0.05），但是與20h組差異不顯著（P>0.05）；22h組顯核率最高，與20、21h組差異不顯著（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

體細(xì)胞核移植技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵步驟就是受體卵母細(xì)胞的去核，去核的成功率直接影響核移植的整體效率，傳統(tǒng)的盲吸法對(duì)操作者的技術(shù)熟練水平要求較高，并且去除胞質(zhì)較多，不利于核移植胚胎后期的發(fā)育。利用DEME進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)去核不僅去除胞質(zhì)量較少，而且化學(xué)誘導(dǎo)劑作用時(shí)間較短，所以對(duì)核移植胚胎的后期發(fā)育并無明顯不良影響，近年來成為采用較多的一種主流方法。應(yīng)用DEME誘導(dǎo)去核通常采用2種方式：一種是將激活處理后的卵母細(xì)胞在一定濃度的DEME中處理相應(yīng)的時(shí)間，使同源染色體隨著第二極體排出胞質(zhì)，這種方式在小鼠[9]、山羊[9]、兔[10]、牛[11]上都有研究報(bào)道；另一種是將減數(shù)第二次分裂中期卵母細(xì)胞經(jīng)過DEME處理后，染色質(zhì)在卵母細(xì)胞胞質(zhì)表面形成一個(gè)包狀的突起，在顯微鏡下利用顯微操作去掉突起，同樣可以達(dá)到去核的目的，主要應(yīng)用在豬[6]、牛[12]等家畜方面。

DEME誘導(dǎo)去核的方法在不同動(dòng)物和不同試驗(yàn)體系下所采用的濃度及作用時(shí)間各不相同，Russell等報(bào)道，在牛上用DEME誘導(dǎo)去核時(shí)采用0.6μg/mL濃度處理90min較好[7]；Meng等采用0.4μg/mL濃度處理30～40min較好[3]，而本研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.5μg/mL時(shí)顯核率最高，且顯著高于0.4μg/mL組（P<0.05），這與王強(qiáng)等在小鼠上的研究結(jié)果[13]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，有些在前段時(shí)間沒有胞質(zhì)突起的在后來會(huì)出現(xiàn)胞質(zhì)突起，所以筆者認(rèn)為化學(xué)誘導(dǎo)去核作為一種輔助的手段在實(shí)際應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)各自的試驗(yàn)條件探索適宜體系，一般進(jìn)行體細(xì)胞核移植研究時(shí)都會(huì)根據(jù)受體卵母細(xì)胞數(shù)量而進(jìn)行多批次的去核操作，這樣就可以分別在30、60、90min等時(shí)間點(diǎn)（或根據(jù)試驗(yàn)進(jìn)度）多次挑選具有胞質(zhì)突起的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核操作。

由于卵母細(xì)胞的細(xì)胞核位置會(huì)隨著IVM時(shí)間的延長(zhǎng)而遠(yuǎn)離第一極體[14]，所以筆者研究了IVM時(shí)間對(duì)DEME誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞顯核效果的影響，結(jié)果顯示22h組顯核率最高，但是與20、21h組差異不顯著（P>0.05），說明在牛卵母細(xì)胞IVM20～22h這段時(shí)間里進(jìn)行DEME處理效果較適宜，同時(shí)在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DEME誘導(dǎo)的胞質(zhì)突起距離第一極體較遠(yuǎn)的概率增高，這與李裕強(qiáng)等的報(bào)道[14-15]一致。

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[6]YinXJ，TaniT，YonemuraI，etal.Productionofclonedpigsfromadultsomaticcellsbychemicallyassistedremovalofmaternalchromosomes[J].BiologyofReproduction，2002，67（2）：442-446.

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[8]Costa-BorgesN，ParamioMT，CalderónG，etal.Antimitotictreatmentsforchemicallyassistedoocyteenucleationinnucleartransferprocedures[J].CloningandStemCells，2009，11（1）：153-166.

[9]Costa-BorgesN，ParamioMT，SantalóJ，etal.Demecolcine-andnocodazole-inducedenucleationinmouseandgoatoocytesforthepreparationofrecipientcytoplastsinsomaticcellnucleartransferprocedures[J].Theriogenology，2011，75（3）：527-541.

[10]YinXJ，KatoY，TsunodaY.Effectofenucleationproceduresandmaturationconditionsonthedevelopmentofnuclear-transferredrabbitoocytesreceivingmalefibroblastcells[J].Reproduction，2002，124（1）：41-47.

[11]王玉涵，朱玉霞，尹多，等.化學(xué)輔助去核法對(duì)延邊黃牛卵母細(xì)胞去核率及其重構(gòu)胚發(fā)育率的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（2）：340-344.

[12]SongK，HyunSH，ShinT，etal.Post-activationtreatmentwithdemecolcineimprovesdevelopmentofsomaticcellnucleartransferembryosinpigsbymodifyingtheremodelingofdonornuclei[J].MolecularReproductionandDevelopment，2009，76（7）：611-619.

[13]王強(qiáng)，安志興，顧玲，等.脫羰秋水仙堿誘導(dǎo)昆明白小鼠卵母細(xì)胞去核的研究[J].遺傳，2004，26（5）：653-657.

[14]李裕強(qiáng)，張琇，安志興，等.牛卵母細(xì)胞的去核與激活[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，32（11）：6-10.

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2.3IVM時(shí)間對(duì)DEME誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞顯核效果的影響

牛COCs經(jīng)IVM不同時(shí)間之后，DEME誘導(dǎo)顯核結(jié)果如表3所示，其中19h組顯核率最低，且顯著低于21、22h組（P<0.05），但是與20h組差異不顯著（P>0.05）；22h組顯核率最高，與20、21h組差異不顯著（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

體細(xì)胞核移植技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵步驟就是受體卵母細(xì)胞的去核，去核的成功率直接影響核移植的整體效率，傳統(tǒng)的盲吸法對(duì)操作者的技術(shù)熟練水平要求較高，并且去除胞質(zhì)較多，不利于核移植胚胎后期的發(fā)育。利用DEME進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)去核不僅去除胞質(zhì)量較少，而且化學(xué)誘導(dǎo)劑作用時(shí)間較短，所以對(duì)核移植胚胎的后期發(fā)育并無明顯不良影響，近年來成為采用較多的一種主流方法。應(yīng)用DEME誘導(dǎo)去核通常采用2種方式：一種是將激活處理后的卵母細(xì)胞在一定濃度的DEME中處理相應(yīng)的時(shí)間，使同源染色體隨著第二極體排出胞質(zhì)，這種方式在小鼠[9]、山羊[9]、兔[10]、牛[11]上都有研究報(bào)道；另一種是將減數(shù)第二次分裂中期卵母細(xì)胞經(jīng)過DEME處理后，染色質(zhì)在卵母細(xì)胞胞質(zhì)表面形成一個(gè)包狀的突起，在顯微鏡下利用顯微操作去掉突起，同樣可以達(dá)到去核的目的，主要應(yīng)用在豬[6]、牛[12]等家畜方面。

DEME誘導(dǎo)去核的方法在不同動(dòng)物和不同試驗(yàn)體系下所采用的濃度及作用時(shí)間各不相同，Russell等報(bào)道，在牛上用DEME誘導(dǎo)去核時(shí)采用0.6μg/mL濃度處理90min較好[7]；Meng等采用0.4μg/mL濃度處理30～40min較好[3]，而本研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.5μg/mL時(shí)顯核率最高，且顯著高于0.4μg/mL組（P<0.05），這與王強(qiáng)等在小鼠上的研究結(jié)果[13]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，有些在前段時(shí)間沒有胞質(zhì)突起的在后來會(huì)出現(xiàn)胞質(zhì)突起，所以筆者認(rèn)為化學(xué)誘導(dǎo)去核作為一種輔助的手段在實(shí)際應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)各自的試驗(yàn)條件探索適宜體系，一般進(jìn)行體細(xì)胞核移植研究時(shí)都會(huì)根據(jù)受體卵母細(xì)胞數(shù)量而進(jìn)行多批次的去核操作，這樣就可以分別在30、60、90min等時(shí)間點(diǎn)（或根據(jù)試驗(yàn)進(jìn)度）多次挑選具有胞質(zhì)突起的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核操作。

由于卵母細(xì)胞的細(xì)胞核位置會(huì)隨著IVM時(shí)間的延長(zhǎng)而遠(yuǎn)離第一極體[14]，所以筆者研究了IVM時(shí)間對(duì)DEME誘導(dǎo)牛卵母細(xì)胞顯核效果的影響，結(jié)果顯示22h組顯核率最高，但是與20、21h組差異不顯著（P>0.05），說明在牛卵母細(xì)胞IVM20～22h這段時(shí)間里進(jìn)行DEME處理效果較適宜，同時(shí)在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DEME誘導(dǎo)的胞質(zhì)突起距離第一極體較遠(yuǎn)的概率增高，這與李裕強(qiáng)等的報(bào)道[14-15]一致。

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