包永睿， 王 帥， 楊欣欣， 孟憲生*， 蔡 琳

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧大連116600）

葛根異黃酮類成分對缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞保護(hù)作用的研究

包永睿1，2，3， 王 帥1，2，3， 楊欣欣1，2，3， 孟憲生1，2，3*， 蔡 琳1

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧大連116600）

目的建立葛根異黃酮類成分的HPLC指紋圖譜，分析其對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用的相關(guān)性。方法HPLC-TOF-MS法對葛根異黃酮各指紋峰進(jìn)行辨認(rèn)，并考察不同劑量葛根異黃酮給藥組對乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，然后采用灰色關(guān)聯(lián)分析法將峰面積和細(xì)胞存活率藥效數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。結(jié)果從HPLC指紋圖譜中鑒定出7個葛根異黃酮類成分，分別為葛根素、3′-羥基葛根素、葛根素木糖苷、3′-甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷和大豆苷元，這些成分的藥效并無很大差異，相關(guān)系數(shù)最大值葛根素 （0.761 4）與最小值大豆苷 （0.670 8）之間相差不到0.1。結(jié)論葛根異黃酮保護(hù)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的作用可能是通過多組分協(xié)同而發(fā)揮療效。

葛根異黃酮；HPLC；心肌細(xì)胞；缺氧復(fù)氧損傷；灰色關(guān)聯(lián)分析法；相關(guān)性

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根部［1］，臨床主要用于治療心腦血管疾病，研究表明［2］，異黃酮類成分是其發(fā)揮擴(kuò)張血管、降低血管阻力、抗心律失常等藥理作用的主要活性成分。本實驗經(jīng)前期提取純化，已分離富集得到葛根異黃酮類組分 （純度＞80%），現(xiàn)針對該組分建立HPLC指紋圖譜，同時考察其對缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。然后，采用灰色關(guān)聯(lián)分析法構(gòu)建所鑒定出的7種主要成分與藥效間的相關(guān)性，從而明確其治療冠心病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為葛根藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)，也給該植物的進(jìn)一步研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 主要儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；CP225D電子分析天平 （十萬分之一，德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水處理裝置（美國Millipore公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國Nuaire公司）；AE31型倒置相差顯微鏡（德國Motic公司）；SUNRISE酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.2 主要試藥 葛根藥材購自河北省安國藥材批發(fā)市場，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根部。葛根素對照品 （批號110752-200511），購自中國食品藥品檢定研究院；大豆苷 （批號 MUST-11121201）、大豆苷元 （批號MUST-12020708）對照品，均購自成都曼思特生物科技有限公司；葛根素-7-木糖苷 （批號130916）、葛根素木糖苷 （批號130913）對照品，均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇、磷酸為色譜純，均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清，均購自美國Gibco公司。

1.3 細(xì)胞株與實驗動物 原代乳鼠心肌細(xì)胞，本實驗室自行培養(yǎng)；清潔級昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXX（遼）2008-0002。

2 實驗方法

2.1 葛根異黃酮指紋圖譜的建立與峰歸屬

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取葛根素、大豆苷、大豆苷元、葛根素木糖苷、葛根素-7-木糖苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 m L含大豆苷元0.083 0 mg、葛根素0.087 0 mg、大豆苷0.083 9 mg、葛根素木糖苷0.082 4 mg、葛根素-7-木糖苷0.083 3 mg的對照品溶液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取葛根粉末（過40目篩）4、8、12 g，分別置于平底燒瓶中，70%乙醇回流提取3次，每次1 h，提取液過濾后濃縮，經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化，收集50%乙醇洗脫液，減壓干燥后分別用水定容至50 mL量瓶中，0.45μm濾膜過濾，即得［3］。

2.1.3 HPLC色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；體積流量1.0 mL/min；柱溫25℃；流動相為水 （A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，9%→10%B；10～15 min，10%→12%B；15～65 min，12%→14%B；65～67 min，14%→15%B；67～110 min，15%→30%B）；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量10μL［4］。

2.1.4 MS分析條件 電噴霧離子源，負(fù)離子模式檢測；霧化氣體為氮?dú)?；體積流量540 L/h；脫溶劑氣體溫度350℃；錐孔氣流量50 L/h；離子源溫度120℃；錐孔電壓45 V；毛細(xì)管電壓4 kV；霧化器壓力35 psi；碎裂電壓175 V；質(zhì)譜圖平均掃描速率0.2 s，掃描范圍m/z100～1 100。應(yīng)用Agilent MassHunter Qualitative Analysis軟件對質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，同時研究供試品所含成分的裂解規(guī)律，并與對照品比對確認(rèn)［5］。

2.2 葛根異黃酮對缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

2.2.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 取新生SD小鼠若干只，無菌條件下開胸取心，洗凈后將心室剪成碎塊放入培養(yǎng)皿里，加入適量冷PBS，置于37℃水浴中用消化液多次消化，收集細(xì)胞懸液，差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞，37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個/mL，轉(zhuǎn)接于96孔板上，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。然后，選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，于72 h后進(jìn)行實驗［6-7］。

2.2.2 缺氧復(fù)氧損傷模型的制備 取接種完成的96孔板，每孔加入等量的H2O2（100μmol/L）損傷劑，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)1 h后，換成正常的培養(yǎng)液，繼續(xù)在相同條件下常規(guī)培養(yǎng)。

2.2.3 含藥血漿對缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 將SD小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，除1組為空白對照組外，其余3組分別為葛根高、中、低劑量組 （給藥劑量按生藥量計算，分別為0.8、1.6、2.4 g/kg），灌胃給藥3 d，每天1次，每次0.5 mL。然后，摘除小鼠眼球取血，置于肝素化的EP管中，緩慢搖晃，離心15 min后吸取上清液，即為含藥血漿，分裝。然后，取已缺氧復(fù)氧的原代乳鼠心肌細(xì)胞，分別加入15%濃度的含藥血漿，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后，每孔避光加入MTT試劑20μL（5 mg/mL），37℃下繼續(xù)孵育4 h，棄除上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，室溫下?lián)u床30 min。待紫色結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀在492 nm波長下測定OD值，計算藥物對細(xì)胞的存活率［8］，計算公式如下。

細(xì)胞存活率=OD實驗組/OD對照組×100%

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較用單因素方差和LSD檢驗分析。

2.4 灰色關(guān)聯(lián)度分析 采用灰色關(guān)聯(lián)分析法，將葛根異黃酮HPLC指紋圖譜各峰的峰面積和細(xì)胞存活率藥效數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后，計算其關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度［9-12］。

3 實驗結(jié)果

3.1 葛根異黃酮指紋圖譜及藥效學(xué)分析結(jié)果 見圖1和表1。

圖1 葛根異黃酮指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of pueraria isoflavones

表1 HPLC-MS與藥效學(xué)分析結(jié)果Tab.1 HPLC-M S and pharmacodynam ic analysis results

其中，3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素是根據(jù)化合物自身裂解規(guī)律，并經(jīng)文獻(xiàn) ［5］與相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息比對推測所得，其他化合物均為對照品指認(rèn)成分。

3.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果 見圖2和表2，根據(jù)藥效-劑量關(guān)聯(lián)直觀分析結(jié)果，可大致分析因素數(shù)列的關(guān)聯(lián)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，峰面積與存活率較接近，表明關(guān)聯(lián)度較好。

圖2 藥效-劑量關(guān)聯(lián)圖Fig.2 E fficacy-dose related graph

表2 灰色關(guān)聯(lián)度分析系數(shù)Tab.2 Analysis coefficient of grey relation

由此可知，葛根異黃酮中的成分對缺氧復(fù)氧損傷模型的乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響依次為S2＞S5＞S4＞S1＞S3＞S7＞S6，即2號峰葛根素對細(xì)胞存活率影響最大，其次為葛根素木糖苷、葛根素-7-木糖苷、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷元與大豆苷。

4 討論

在前期實驗中，已分離富集得到純度相對較高的葛根異黃酮類成分，而本實驗在此基礎(chǔ)上，采用HPLC-TOF-MS法建立了該類組分的指紋圖譜，并對其化合物構(gòu)成進(jìn)行基本表征，結(jié)果鑒定出葛根素木糖苷、葛根素-7-木糖苷、3′-羥基葛根素等7種主要成分。同時，體外細(xì)胞實驗考察了其對缺氧復(fù)氧損傷乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，然后采用灰色關(guān)聯(lián)分析法，建立了各成分與藥效間的相關(guān)性。

在研究以上7種成分對缺氧復(fù)氧損傷模型的乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響時發(fā)現(xiàn)，葛根素對藥效結(jié)果影響最大，相關(guān)系數(shù)為0.761 4，表明目前葛根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以葛根素作為含量控制指標(biāo)的科學(xué)性與合理性。同時，由灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果可知，這些成分與藥效相關(guān)性并無很大差異，相關(guān)系數(shù)最大值葛根素 （0.761 4）與最小值大豆苷 （0.670 8）之間相差不到0.1，這可能與該類化合物的母核結(jié)構(gòu)一致有關(guān)。另外，沒有一個化合物表現(xiàn)出明顯的藥效相關(guān)性 （0.9以上），這也從另一角度體現(xiàn)了多組分協(xié)同發(fā)揮療效的優(yōu)勢。

本實驗成功建立了葛根異黃酮對缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞保護(hù)作用的相關(guān)性，初步揭示了葛根發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也為葛根藥材的質(zhì)量控制、異黃酮類成分治療冠心病的研究開發(fā)與大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：312.

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Protective effect of pueraria isoflavones on m yocardial cell with hypoxia/reoxygenation injury

BAO Yong-rui1，2，3， WANG Shuai1，2，3， YANG Xin-xin1，2，3， MENG Xian-sheng1，2，3*， CAILin1
（1.College of Pharmcy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；2.Liaoning Province Multi-component Chinese Medicine Fngineering Technology Research Center，Dalian 116600，China；3.Liaoning Province Modern Traditional Chinese Medicine Research and Fngineering Laboratory，Dalian 116600，China）

AIMTo establish the HPLC fingerprintof pueraria isoflavones and to analyze the relationship between these constituents and their protective effect on hypoxia/reoxygenation injury myocardial cells.METHODSHPLC-TOF-MSmethod was used to identify the fingerprint of pueraria isoflavones，and ratmyocardial cells with hypoxia/reoxygenation injury were treated with different dosages of these constituents to research their protective effects.The grey correlation analysiswas applied to associating the fingerprint peak areas with cell survival rates.RESULTSSeven peaks from HPLC fingerprint of pueraria isoflavones were found and elucidated as puerarin，3′-hydroxy puerarin，puerarin-xyloside，3′-methoxypuerarin，puerarin-7-wood glycoside，daidzin and isoflavoues aglycone.There was little difference in cell survival rate between the maximum（0.761 4，puerarin）and minimum value（0.670 8，daidzin）.CONCLUSIONThe protective effect of pueraria isoflavones on hypoxia/reoxygenation injurymyocardial cellsmay be due to the synergistic action ofmulti-constituents.

pueraria isoflavones；HPLC；myocardial cells；hypoxia/reoxygenation injury；grey correlation analysis；correlation

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1514-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.025

2014-08-20

十一五 “重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項項目 （2010ZX09401-304-515）；沈陽市科技計劃項目 （F12-146-9-00）

包永睿 （1978—），男，碩士，實驗師，從事中藥質(zhì)量分析及作用機(jī)制研究工作。Tel：（0411）85890185，E-mail：byr1026 @163.com

*通信作者：孟憲生 （1964—），男，博士，教授，從事中藥組分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析工作。Tel： （0411）85890185，E-mail：mxsvvv@126.com