任衛(wèi)高， 楊 洋， 葛少波， 裴燕芳， 章 冠， 潘金火

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023）

清肺消痤凝膠提取物平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測定

任衛(wèi)高， 楊 洋， 葛少波， 裴燕芳， 章 冠， 潘金火*

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023）

目的測定清肺消痤凝膠提取物及其指標(biāo)成分在不同溶劑中的平衡溶解度和不同pH下的表觀油水分配系數(shù)，為其經(jīng)皮給藥研究提供依據(jù)。方法采用沉淀法測定提取物的溶解度，以指標(biāo)成分法測定大黃酚、黃芩苷和小檗堿在不同溶劑中的平衡溶解度以及在正辛醇/水和正辛醇/緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果37℃時(shí)提取物在丙酮和乙醇中的溶解度較大，而在PBS緩沖體系中的溶解度呈先減小后增大的趨勢，大黃酚、黃芩苷和小檗堿在PBS緩沖液中的溶解度均隨pH的增大而增大；大黃酚的表觀油水分配系數(shù)在pH 5.12時(shí)達(dá)到最大，黃芩苷和小檗堿的油水分配系數(shù)隨pH增大而減小。結(jié)論清肺消痤凝膠提取物在中等極性的溶劑中溶解性較好，pH對于提取物的表觀油水分配系數(shù)有較大影響，可通過調(diào)節(jié)pH來增加藥物的經(jīng)皮吸收。

平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)；大黃酚；黃芩苷；小檗堿

清肺消痤凝膠處方最早源于 《醫(yī)宗金鑒》之 “顛倒散”，在長期的臨床實(shí)踐中經(jīng)化裁而成，具有清肺解毒、化濕消腫、祛瘀散結(jié)的功效，主治肺經(jīng)血熱及濕熱瘀滯之痤瘡。該方主要由大黃、黃芩、黃柏、硫磺等藥味組成，處方提取物中大黃酚、黃芩苷和小檗堿分別是君藥和臣藥中的主要藥效成分，本實(shí)驗(yàn)以上述三者的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)結(jié)合沉淀法測定提取物溶解度，綜合評價(jià)提取物的理化性質(zhì)，以期為清肺消痤凝膠經(jīng)皮給藥新劑型提供理論依據(jù)［1-5］。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀，Waters-2998紫外檢測器，Empower色譜工作站；色譜柱為HederaODS-2柱（江蘇漢邦科技有限公司）；AG135型電子天平 （瑞士梅特勒公司）；FA1104N電子分析天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；AS20500A超聲清洗器 （天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；TDZ4-WS臺式低速離心機(jī) （長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；DKZ-2型電熱恒溫震蕩水槽 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；PHS-3型pH計(jì) （上海儀電科學(xué)股份有限公司）。

大黃酚對照品 （批號0796-200208，供含量測定用）、黃芩苷對照品 （批號0715-200212，供含量測定用）、鹽酸小檗堿對照品 （批號0713-9906，供含量測定用）均購自中國食品藥品檢定研究院；磷酸 （南京化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉 （汕頭市西隴化工廠有限公司）；正辛醇（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；清肺消痤凝膠提取物 （自制，批號20140113）；甲醇 （色譜純，山東禹王試劑有限公司）、乙腈 （色譜純，美國天地試劑公司），水為雙蒸水，乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷均為分析純。

2 成分定量測定方法的建立

2.1 大黃酚測定

2.1.1 色譜條件 按照 《中國藥典》2010年版一部大黃項(xiàng)下，HederaODS-2色譜柱，流動相為甲醇-0.1%磷酸（85∶15），體積流量1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長254 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定大黃酚對照品2.4mg至100 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為24μg/mL的大黃酚對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取提取物0.1 g，置于10 mL的量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.1.4 陰性供試品溶液的制備 制備缺大黃的清肺消痤凝膠提取物，精密稱取0.1 g，置于10 mL的量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45μm濾膜，即得。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取一定量上述大黃酚對照品溶液，按倍數(shù)關(guān)系稀釋成6種不同質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取10μL，記錄色譜峰積分面積。以各大黃酚對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），相應(yīng)的對照品峰面積積分值為縱坐標(biāo) （Y），進(jìn)行回歸處理，得回歸方程：Y=14 772X-36 695，r=0.999結(jié)果表明，大黃酚在1.2～24μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 專屬性考察 精密量取大黃酚對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10μL，按照 “2.1.1”項(xiàng)下色譜方法測定。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性樣品色譜在此保留時(shí)間無干擾，證明本法可行。

2.2 黃芩苷測定

2.2.1 色譜條件 按照 《中國藥典》2010年版一部黃芩項(xiàng)下，色譜柱HederaODS-2柱，流動相為甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），體積流量1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長280 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定黃芩苷對照品3.36 mg至50 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為67.2μg/mL的黃芩苷對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取提取物0.1 g，置于10 mL的量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 制備缺黃芩的清肺消痤凝膠提取物，精密稱取0.1 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45μm濾膜，即得。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取一定量上述黃芩苷對照品溶液，按倍數(shù)關(guān)系稀釋成6種不同質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取10μL，記錄色譜峰積分面積。以各黃芩苷對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），相應(yīng)的對照品峰面積積分值為縱坐標(biāo) （Y），進(jìn)行回歸處理，得回歸方程Y=53 342X-5 205，r=0.999，結(jié)果表明，黃芩苷在3.36～67.2μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 專屬性考察 精密量取黃芩苷對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10μL，按照 “2.2.1”項(xiàng)下色譜方法測定。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性樣品色譜在此保留時(shí)間無干擾，證明本法可行。

2.3 小檗堿測定

2.3.1 色譜條件 按照 《中國藥典》2010年版一部黃柏項(xiàng)下，色譜柱HederaODS-2柱，流動相為磷酸-乙腈（50∶50）（每100mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g），柱溫35℃，體積流量1 mL/min，檢測波長265 nm。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱定小檗堿對照品1.33 mg至10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.133 mg/mL的小檗堿對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取提取物0.1 g，置于10mL的量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.3.4 陰性供試品溶液的制備 制備缺黃柏的清肺消痤凝膠提取物，精密稱取0.1 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45μm濾膜，即得。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取一定量上述小檗堿對照品溶液，按倍數(shù)關(guān)系稀釋成6種不同質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取10μL，記錄色譜峰積分面積。以各小檗堿對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），相應(yīng)的對照品峰面積積分值為縱坐標(biāo) （Y），進(jìn)行回歸處理，得回歸方程Y=53 710X-2 161，r=0.999，結(jié)果表明，小檗堿在5.32～66.2μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6 專屬性考察 精密量取小檗堿對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10μL，按照 “2.3.1”項(xiàng)下色譜方法測定。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性樣品色譜在此保留時(shí)間無干擾，證明本法可行。

3 方法與結(jié)果

3.1 平衡溶解度實(shí)驗(yàn)

3.1.1 沉淀法［6］取清肺消痤凝膠提取物0.2 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入不同溶劑10 mL，始終保持量瓶中有固體藥物存在，塞上塞子，放入恒溫水浴振蕩器中，溫度保持在37℃，振搖24 h，使其達(dá)到充分溶解。將錐形瓶中的藥液連同殘留的固體藥物一同轉(zhuǎn)移至已經(jīng)恒定質(zhì)量的離心管中，離心管在3 500 r/min下離心10 min，傾出上清液，底部殘?jiān)碗x心管在60℃烘干至恒定質(zhì)量，稱定質(zhì)量，計(jì)算提取物在不同溶劑中的溶解度，結(jié)果見表1，不同pH的磷酸緩沖液中的平衡溶解度見圖1。實(shí)驗(yàn)中選擇的溶劑有水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正辛醇、三氯甲烷以及緩沖體系，pH分別為3.23、4.05、5.12、6.79、7.39、8.07、8.94、10.27，所用緩沖溶液均以0.1 mol/L的磷酸加飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至所需pH。

溶解度=（m加入量-m未溶解量）/V溶劑體積

表1 提取物在37℃條件下不同溶劑中的溶解性能考察

圖1 提取物在37℃條件下不同pH的磷酸緩沖液中的溶解性能考察

3.1.2 指標(biāo)成分法［6］分別精密吸取上述離心過后的各溶液和磷酸緩沖液上清液4mL至10mL量瓶中，加甲醇充分混勻，稀釋至刻度線。經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液10μL用高效液相色譜法測定溶液中大黃酚、黃芩苷和小檗堿，并計(jì)算各指標(biāo)藥效成分在不同溶劑中的平衡溶解度。結(jié)果顯示，37℃下大黃酚在水中的平衡溶解度為1.09 μg/mL，黃芩苷在水中的平衡溶解度為158.56μg/mL，小檗堿的平衡溶解度為44.48μg/mL，而在有機(jī)溶劑中的平衡溶解度結(jié)果見表2，在磷酸緩沖體系中的平衡溶解度見圖2。由結(jié)果可知，37℃時(shí)大黃酚、黃芩苷和小檗堿在甲醇中的溶解度最大，在丙酮和乙醇中的溶解度相對較大，在乙酸乙酯中的溶解度最小。在PBS緩沖體系中大黃酚、黃芩苷和小檗堿的溶解度受pH的影響較大，都隨著pH的增加而變大，大黃酚和小檗堿的溶解度均在pH在6.8～7.4范圍內(nèi)變化較顯著。

表2 大黃酚、黃芩苷和小檗堿在37℃不同溶劑中的平衡溶解度

圖2 3種成分在37℃條件下不同pH的磷酸緩沖液中的平衡溶解度

3.2 表觀油水分配系數(shù)的測定［7］稱取清肺消痤凝膠提取物適量至10 mL量瓶中，加入被正辛醇飽和的水和不同pH的PBS緩沖液 （pH分別為3.23、4.05、5.12、6.79、7.39、8.07、8.94、10.27，所用緩沖溶液均以0.1 mol/L的磷酸加飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至所需pH）超聲30 min，使其充分溶解，用相同溶劑定容至刻度，保證一直有固體藥物存在，使其呈飽和狀態(tài)，靜止后離心 （3 500 r/min，10 min），上清液4 mL，用甲醇稀釋至10 mL，取上清液過0.45μm濾膜，取10μL經(jīng)HPLC測定其中指標(biāo)成分的濃度為C0，再取上清液5 mL至具塞錐形瓶中，分別加入5 mL被水飽和過的正辛醇溶液，塞上塞子，放入恒溫水浴振蕩器中，溫度保持在37℃，振搖24 h，靜止后取上層油相4 mL，用甲醇稀釋至10 mL，混勻，過0.45μm濾膜，取10 μL經(jīng)HPLC測定其中指標(biāo)成分的濃度為C1。按照公式計(jì)算表觀油水分配系數(shù) （P），計(jì)算公式如下

P=C1/（C0-C1）

結(jié)果，37℃下大黃酚、黃芩苷和小檗堿的正辛醇/水分配系數(shù)分別為5.557（lgP=0.745）、0.204（lg P= -0.689）和0.294（lg P=-0.531）。大黃酚在pH達(dá)到5.12時(shí)lg P值達(dá)到最大為1.57，隨后隨著pH的增加lg P值減小，當(dāng)pH大于7.39以后，大黃酚的lg P值保持穩(wěn)定。黃芩苷和小檗堿在PBS緩沖液的表觀油水分配系數(shù)隨著pH的增加整體呈降低趨勢。結(jié)果見圖3。

圖3 3種成分在37℃下不同pH的緩沖液中的油水分配系數(shù)

4 討論

中藥提取物是多組分的混合物，其中的各個(gè)化合物的性質(zhì)不盡相同，因此中藥提取物的溶解是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中存在化合物之間的競爭性抑制和助溶的雙重作用［8］。提取物溶液是否達(dá)到飽和并不能代表指標(biāo)成分是否也達(dá)到飽和溶解度，為了方便比較，并能客觀地反映提取物在不同溶劑中的溶解性，本實(shí)驗(yàn)過程中在不同溶劑中加入等量的提取物，并同時(shí)保證在不同溶劑系統(tǒng)中均有大量不溶物存在的情況下，在相同條件下比較提取物和指標(biāo)成分在不同溶劑中的溶解性能。

體外油水分配系數(shù)是影響藥物胃腸吸收和經(jīng)皮吸收的重要因素，它反映了藥物透過生物膜的能力和在組織液中分配的能力，藥物必須具有一定的油溶性和一定的水溶性，其穿透能力才比較理想。文獻(xiàn)［9］報(bào)道，藥物吸收的最佳范圍是-1＜lg P＜2，過低的lg P值（lg P＜-2）化合物不能穿過脂質(zhì)膜；相反，過高的lg P值 （lg P＞3）化合物因?yàn)橹苄詮?qiáng)而很難進(jìn)入附近的血管或淋巴管，轉(zhuǎn)運(yùn)至全身。

清肺消痤凝膠劑中君藥大黃和臣藥黃柏、黃芩中的藥效指標(biāo)成分分別為大黃酚、黃芩苷和小檗堿，具有清熱解毒廣譜抗菌，抗病毒的作用。因此本實(shí)驗(yàn)選擇大黃酚、黃芩苷和小檗堿作為評價(jià)清肺消痤凝膠提取物溶解度和油水分配系數(shù)的指標(biāo)具有一定程度的代表性。

采用沉淀法評價(jià)提取物在不同溶劑和緩沖液中的整體溶解度，結(jié)果顯示，提取物在不同試劑中的溶解度順序?yàn)楸疽掖迹舅炯状迹疽宜嵋阴ィ救燃淄椋菊链迹疽译?，提取物在丙酮和乙醇中的溶解度較大，說明提取物在中等極性的溶劑中溶解性較好，在設(shè)計(jì)經(jīng)皮給藥制劑時(shí)可以考慮適量加入丙酮和乙醇作為載體溶劑，以提高藥物的溶解度。在不同pH的緩沖液中的溶解度試驗(yàn)顯示提取物在不同緩沖體系中的溶解度均大于其在水中的溶解度，且在pH范圍在3.23～6.79的酸性環(huán)境下，藥物溶解度隨著pH的增加而減小，在pH范圍在6.79～10.27的堿性環(huán)境下，藥物溶解度隨著pH的增加而迅速增加，因此建議在進(jìn)行消痤凝膠劑的研究過程中應(yīng)該考慮pH對藥物溶解度的影響。

提取物中大黃酚在不同pH的緩沖液中的溶解度隨著pH的增加而增加，這是由于隨著pH的增加大黃酚分子中的羥基不斷地解離，使大黃酚不斷地溶出，但由于大黃酚是多羥基的蒽醌類化合物，脂溶性很強(qiáng)，因此其在由正辛醇和PBS緩沖液組成的油水分配系統(tǒng)中測定的lg P值較高，范圍為0.43＜lg P＜1.56，而且當(dāng)pH大于7.39以后，大黃酚的lg P值保持穩(wěn)定。提取物中黃芩苷在不同pH的緩沖液中的溶解度隨著pH的增加而增加，但是lg P值隨著pH的增加而減小，這可能是由于黃芩苷是弱酸性黃酮類化合物，在堿性環(huán)境下的溶解度要大于酸性環(huán)境，隨著pH的不斷增加，黃芩苷中的酚羥基不斷解離，使黃芩苷由分子狀態(tài)變?yōu)殡x子態(tài)，水溶性增加，因此其表觀油水分配系數(shù)會不斷減小。提取物中小檗堿在不同pH的緩沖液中的溶解度隨著pH的增加而增加，但是lg P值隨著pH的增加整體呈降低趨勢；在不同pH溶液中，小檗堿以不同的形式存在。在酸性溶液中，小檗堿失去電子以鹽的形式存在，由于其特殊物理性質(zhì)，雖然此時(shí)化學(xué)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，但其溶解度降低。隨著溶液pH不斷增加，小檗堿逐漸以鹽的形式向氮雜縮醛的形式轉(zhuǎn)變，穩(wěn)定性逐漸降低，但其在水中的溶解度卻大大提高，加之有大黃酚和黃芩苷等酸性化合物的存在，小檗堿在正辛醇中的溶解度不斷地減小。

由上述平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測定可知，清肺消痤凝膠提取物以及其指標(biāo)成分的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)均受pH的影響很大，故在優(yōu)選制劑工藝時(shí)應(yīng)注意選擇合適的pH，以提高有效成分的經(jīng)皮吸收速率。

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R284.2

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：1001-1528（2015）07-1613-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.052

2014-07-

江蘇省科技廳社會發(fā)展項(xiàng)目 （BE2009682）

任衛(wèi)高（1989—），男，碩士生，從事中藥新劑型開發(fā)研究。Tel：18252067572，E-mail：gaogao8967@163.com

*通信作者：潘金火 （1963—），男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥制劑和新藥研發(fā)。Tel：13951856876，E-mail：panjinhuo@ 163.com