孔曉君 韓俊嶺 高 鑫 李建遠

腎缺血再灌注損傷是一個常見的臨床問題，也是造成急性腎衰竭和移植腎功能延遲恢復的主要原因之一。其損傷機制還未完全明確，主要涉及活性氧的釋放、炎性因子的釋放，細胞凋亡等［1，2］。熱休克蛋白是保護性蛋白家族，構(gòu)成內(nèi)源性細胞防御機制來抵抗敵對的環(huán)境壓力，在缺氧、缺血、炎癥等壓力刺激下可以誘導表達，按相對分子質(zhì)量大小主要分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60。HSP90 在多種生物均有表達，在正常情況下占胞質(zhì)蛋白的1% ～2%，是最豐富的細胞質(zhì)蛋白之一［3］。真核生物中HSP90 主要有HSP90α、HSP90β 兩種亞型。HSP90α 能夠通過調(diào)控各種細胞因子和客戶蛋白的折疊而起到保護細胞的作用。微小RNA(miRNA)為長度18 ～25nt 的非編碼單鏈低分子RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄前水平調(diào)控基因的表達，介導靶mRNA 降解或抑制蛋白翻譯［4］。筆者利用生物信息學預測出miRNA - 144 為調(diào)控HSP90α 功能的潛在miRNA，然后通過定量RT-PCR和Western blot 法檢測HSP90α 和miRNA -144 在腎缺血再灌注不同時間點的表達情況，初步探討miRNA-144 和HSP90α 在腎缺血再灌注損傷中的調(diào)控作用及機制。

材料與方法

1.動物及模型制備:成年雄性昆明白小鼠，體重30 ～40g，由濱州醫(yī)學院動物實驗中心提供。隨機分成:①缺血再灌注(IR)組(n=40，每組8 只);②假手術(shù)組(n =40，每組8 只)。小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(80/10mg/kg)腹腔麻醉，充分暴露手術(shù)視野固定，乙醇消毒手術(shù)部位，腹部正中切口后分離左右腎蒂，用無損傷血管夾夾閉左右腎蒂，肉眼觀察腎臟變黑說明夾閉成功，45min 后松開血管夾，幾分鐘后腎臟變粉紅，說明再灌注成功。假手術(shù)組只分離左右腎蒂，不夾閉。IR 組和假手術(shù)組分別在術(shù)后4、8、12、24、48h 下腔靜脈取血分離血清，取少量腎組織Bouin 氏液固定，用于病理檢查，剩余腎組織于-80℃保存。

2.主要試劑:HE 試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;RNAiso Plus 購自TaKaRa 公司;ReverTra Ace 反轉(zhuǎn)錄酶購自Toyobo 公司;Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix - UDG反應試劑盒購自Invitrogen 公司;RIPA 裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自煙臺賽爾斯生物技術(shù)有限公司;ECL 購自Thermo 公司;HSP90α 抗體和β-actin 抗體購自Santa Cruz 公司;辣根酶標記的山羊抗兔IgG 購自中杉金橋公司;所用引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

3.生化指標檢測:應用美國德靈Dimension RXL Max 全自動生化分析儀測定血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。

4.組織學評價:小鼠腎組織于Bouin 氏液固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切片4μm，脫蠟水化后用HE 試劑盒染色，光鏡下觀察腎臟的組織形態(tài)變化。

5.miRNA 預測:筆者聯(lián)合使用TargetScan(http://www.targetscan. org/)和miRanda (http://www. microrna. org/microrna/home.do)兩個預測軟件同時預測調(diào)控HSP90α 功能的潛在的miRNA 分子。取TargetScan 和miRanda 共同預測到的miRNA 即miRNA-144 進行下一步研究。

6.熒光定量RT-PCR:IR 組和假手術(shù)組各個時間點的腎組織分別混合后用RNAiso Plus 提取RNA。1μg RNA 用ReverTra Ace 反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)。熒光定量PCR 按照Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix -UDG 反應試劑盒的產(chǎn)品說明進行反應，反應體系為:cDNA 1μl，上游引物(10μmol/L)0.6μl，下游引物(10μmol/L)0.6μl，SYBR mix 10μl，dd H2O 8μl。使用Rotor-Gene Q 進行熒光定量PCR 檢測，反應條件為:50℃2min，95℃5min，95℃10s，60℃45s，40 個循環(huán)。運用2-△△Ct方法來計算樣本中mRNA 表達水平的差異。所有的實驗重復3 次。△△CT=［Ct(實驗組目標基因)- Ct(實驗組內(nèi)參基因)］-［Ct(對照組目標基因)- Ct(對照組內(nèi)參基因)］。mRNA 選用GAPDH 作為內(nèi)參基因，miRNA 選用U6 作為內(nèi)參基因。

7.Western blot 法分析:用RIPA 裂解液提取蛋白樣品，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。電泳轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜上，用HSP90α 抗體(1∶1000)和β-actin 抗體(1∶1500)4℃搖床孵育過夜，清洗。辣根酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5000)37℃孵育1h，清洗。ECL 顯色，掃描后，利用Gene Tools image analysis 軟件(Gene Tools，version 4.02;Syngene，Cambridge，UK)測定條帶灰度值，目標條帶與β -actin 的比值作為表達強度。

8.統(tǒng)計學方法:采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.腎組織形態(tài)學變化:HE 染色可見假手術(shù)組腎小管排列整齊緊密，而IR 組腎小管排列紊亂，管腔擴張;腎小管上皮細胞扁平，部分腫脹、壞死、脫落，刷狀緣消失;管腔內(nèi)可見管型;腎間質(zhì)減少、充血，以再灌注24h 組組織損傷最嚴重(圖1)。

圖1 各組腎組織形態(tài)學變化(HE，×400)

2.腎功能指標變化:假手術(shù)組和IR 組在再灌注4、8、12、24、48h 后血清中Scr 和BUN 的變化，結(jié)果見表2 和表3。與假手術(shù)組相比，IR 組的Scr 和BUN 在4h 時開始增高，24h 時達高峰，48h 有所下降，P 均＜0.01 為差異有統(tǒng)計學意義。

表2 小鼠腎缺血再灌注后各組各時相肌酐水平的變化(μmol/L，±s，n=8)

表2 小鼠腎缺血再灌注后各組各時相肌酐水平的變化(μmol/L，±s，n=8)

組別4h 8h 12h 24h 48h假手術(shù)組 20.15 ±6.15 21.09 ±5.98 23.78 ±6.78 22.18 ±5.78 23.28 ±4.38 IR 組 75.45 ±8.658 82.95 ±7.64 100.15 ±9.13 153.78 ±6.34 87.13 ±5.35 t 14.73 18.10 18.99 43.39 26.12 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 小鼠腎缺血再灌注后各組各時相尿素氮水平的變化(mmol/L，±s，n=8)

表3 小鼠腎缺血再灌注后各組各時相尿素氮水平的變化(mmol/L，±s，n=8)

組別4h 8h 12h 24h 48h假手術(shù)組 7.45 ±4.62 8.01 ±6.92 6.78 ±5.73 7.18 ±3.42 7.6 3 ±4.32 IR 組 29.37 ±7.14 34.55 ±7.23 42.16 ±6.04 60.87 ±5.02 39.75 ±6.89 t 7.29 7.50 12.03 25.00 11.17 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3. 腎缺血再灌注后腎組織中HSP90α mRNA 和miRNA-144 的表達變化:缺血再灌注4、8、12、24、48h 時間點的HSP90α mRNA 相對于各自的假手術(shù)組表達量分別為1.20 ±0.16、1.81 ±0.16、2.64 ±0.17、2.51 ±0.11、1.66 ±0.17，缺血再灌注組相對假手術(shù)組表達明顯升高，且在12h 組表達增加2.64 倍(P ＜0.01)，增加倍數(shù)最多，48h 有所降低但仍高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01，圖2)。缺血再灌注4、8、12、24、48h 時間點的miRNA -144 相對于各自的假手術(shù)組表達量分別為0.45 ±0.08、0.41 ±0.08、0.35 ±0.09、0.29 ±0.07、0.38 ±0.06，與假手術(shù)組相比較，IR 組均表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01，圖3)。

圖2 腎缺血再灌注后HSP90α 的mRNA在不同時間點的表達變化

圖3 腎缺血再灌注后miRNA-144在不同時間點的表達變化

4.腎缺血再灌注后腎組織中HSP90α 蛋白的表達變化:HSP90α 蛋白在假手術(shù)組及再灌注4、8、12、24、48h 組的相對表達量分別為0.16 ±0.02、0.34 ±0.03、0.45 ±0.03、0.60 ±0.03、0.81 ±0.05、0.46 ±0.05，與假手術(shù)組相比，IR 組HSP90α 蛋白水平在缺血再灌注后4h 開始升高，隨著再灌注時間的延長表達逐漸增加，24h 達高峰，48h 有所降低但仍高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P 均＜0.01，圖4)。

討 論

圖4 腎缺血再灌注后HSP90α 蛋白在各組表達的Western blot 法檢測結(jié)果(A)和平均灰度值(B)

HSP90α，是一組高度保守的細胞內(nèi)分子伴侶蛋白質(zhì)，能在環(huán)境、生理、化學等各種應激反應下誘導表達，并通過激活各種細胞通路和酶參與重要的細胞功能，如維持細胞結(jié)構(gòu)，參與細胞分化和細胞保護等。研究表明，預先誘導HSP90α 表達增高能保護心肌細胞對抗缺血和化學缺氧損傷，其機制可能與HSP90α的抗氧化和保護線粒體的功能有關(guān)［5］。另外，最近幾年miRNA 在組織缺血再灌注損傷方面的研究成為熱點，其中在心肌、肝臟缺血再灌注損傷中的研究較多，而miRNA-144 在腎缺血再灌注損傷中的研究尚未見報道［6，7］。

本實驗采用雙側(cè)腎蒂夾閉法建立小鼠腎缺血再灌注損傷模型，研究腎臟中內(nèi)源性HSP90α 和miRNA-144 的表達變化。實驗發(fā)現(xiàn)再灌注4h HSP90α 蛋白和mRNA 表達已開始逐漸增強，mRNA 在12h 達高峰，蛋白水平在24h 達高峰。結(jié)合腎組織的病理變化可知HSP90α 的表達是伴隨腎組織損傷程度的加重而逐漸增加的，同時增加的HSP90α 又不斷改善細胞損傷，使腎組織恢復正常。許多體內(nèi)研究表明HSP90α 表達增高，能對抗一系列應激反應［8，9］。Biermann 等［8］發(fā)現(xiàn)H2S 能介導HSP90α 表達增高而在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注模型中起到保護神經(jīng)和抗凋亡的作用。Jha 等［9］在小鼠肝缺血再灌注模型中也做了類似的研究，HSP90 表達增高對肝缺血再灌注損傷起到了保護作用。另外，Barrera -Chimal 等［10］在大鼠腎臟中轉(zhuǎn)染HSP90α，發(fā)現(xiàn)HSP90α 過表達能通過刺激內(nèi)皮一氧化氮途徑，而對大鼠腎缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用。從這些研究中，可以看出HSP90在缺血再灌注模型中扮演著重要的角色，能夠減少組織損傷，但潛在的分子機制還有待探討。

miRNA 發(fā)揮作用的機制是抑制靶mRNA 分子或蛋白分子的表達。在本實驗中，缺血再灌注組HSP90α 的表達均高于假手術(shù)組，因此推測HSP90α對應的潛在miRNA 表達量在缺血再灌注組應該降低，筆者的miRNA -144 實時定量PCR 結(jié)果正好與這一推測吻合。所以HSP90α 可能是miRNA -144調(diào)控的靶蛋白之一。這也與最近一項研究結(jié)果一致，miRNA-144 在心臟缺血再灌注后表達降低［11］。Pan等［6］研究觀察到，miRNA-1 轉(zhuǎn)基因鼠心臟缺血再灌注模型中，miRNA - 1 表達增高抑制了PKCε 和HSP60 等保護蛋白的表達，使心肌梗死面積增大，加重了心肌損傷。同樣的研究還有miRNA -320 能通過抑制HSP20 的表達而加重心臟缺血再灌注損傷［7］。由此可以推斷，miRNA -144 表達下調(diào)是腎組織應對缺血再灌注損傷使HSP90α 表達上調(diào)的內(nèi)源性保護機制，故敲除miRNA-144 可能成為治療腎缺血再灌注損傷的新策略。

綜上所述，HSP90α 表達上調(diào)和miRNA -144 表達下調(diào)在缺血再灌注中都扮演著重要的角色，對于miRNA-144 是否真正調(diào)控HSP90α，筆者將做進一步的研究驗證，從而為臨床上治療腎缺血再灌注損傷提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

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