孫林芳， 鄭廣娟， 馮 兵， 朱 瑩， 賀嵩敏， 劉 映， 牟 潔

（1.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；3.山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，山東濟(jì)南250000）

白術(shù)揮發(fā)油微乳的制備

孫林芳1，2， 鄭廣娟1，2， 馮 兵1，2， 朱 瑩1， 賀嵩敏1， 劉 映1，2， 牟 潔3*

（1.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；3.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東濟(jì)南250000）

目的通過星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法篩選白術(shù)揮發(fā)油微乳最優(yōu)處方。方法采用微孔稀釋法結(jié)合偽三元相圖優(yōu)選乳化劑、助乳化劑及油的種類；通過星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化微乳處方。結(jié)果空白微乳的最佳處方質(zhì)量比為聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40）-二乙二醇單乙基醚（TranscutolP）-油酸聚乙二醇甘油酯（LabrfilM1944CS）-（H2O）（2.25：0.75：1.5：5.5），最優(yōu)處方中白術(shù)揮發(fā)油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%，制備的空白微乳粒徑為21.2 nm，含藥乳粒徑為25.0 nm。結(jié)論所得白術(shù)揮發(fā)油微乳為澄清透明、黃褐色、均一的液體。

白術(shù)揮發(fā)油；微乳；偽三元相圖；星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面

白術(shù)系菊科植物白術(shù)Atractylodismacrocephalae Koidz的干燥根莖。具有健脾益氣，燥濕利水，止汗安胎之功效［1］。白術(shù)的主要有效成分為揮發(fā)油，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1.01%～1.32%［2］，其中含有量最高的蒼術(shù)酮，占總揮發(fā)油的61%左右［3］。文獻(xiàn)報道白術(shù)揮發(fā)油具有顯著的抗腫瘤活性［4-6］，但白術(shù)揮發(fā)油不穩(wěn)定，易氧化分解，尤其是其主要成分蒼術(shù)酮［7］。郝延軍等［8］對蒼術(shù)酮的常溫穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光照是影響蒼術(shù)酮穩(wěn)定性的主要因素。王虹［7］對白術(shù)揮發(fā)油的提取、氧化分解及抗腫瘤作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明氧化后蒼術(shù)酮和γ-欖香烯的量降為零，室外光照條件下蒼術(shù)酮分解最快。此外，白術(shù)揮發(fā)油幾乎不溶于水，這些特征均使白術(shù)揮發(fā)油的臨床應(yīng)用受到限制。如果能開發(fā)一種新的劑型，提高白術(shù)揮發(fā)油的溶解性和穩(wěn)定性，將能增加其抗腫瘤活性。微乳（microemulsion，ME）是一種由油、水、乳化劑和助乳化劑組成的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，粒徑在10～100 nm之間［9-10］。它既能增加揮發(fā)油的溶解度［11］，又能提高藥物的穩(wěn)定性，具有其他劑型所不具有的優(yōu)勢。本研究旨在利用微板稀釋法［12］繪制偽三元相圖篩選合適的乳化劑、助乳化劑和油相，并采用星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法［13-14］篩選處方，制備最佳白術(shù)揮發(fā)油微乳。

1 儀器與試藥

電子天平（TP-1000A）、HSW-24電熱恒溫水浴鍋 （上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；JB300-D型強(qiáng)力電動攪拌機(jī)（上海標(biāo)本模型廠制造）；磁力攪拌器 （IKA HAS數(shù)顯）；Zetasizer激光粒度儀（英國馬爾文公司）；Agilent1260HPLC（美國Agilent）；EconC多功能酶標(biāo)儀（廣州星云科學(xué)儀器有限公司）；高速臺式離心機(jī) （5430R）；超純水系統(tǒng)（Omni-Genetic，廣州益維生物科技有限公司）。

白術(shù)揮發(fā)油 （實驗室自制）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40） （德國BASF公司）、聚氧乙烯蓖麻油 （EL-35）（德國BASF公司）、二乙二醇單乙基醚（TranscutolP）（法國嘉法獅）、油酸聚乙二醇甘油酯（LabrafilM1944CS）（法國嘉法獅）、氫化蓖麻油聚氧乙烯醚40（Co-40）（法國嘉法獅）、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯 （Labrasol）（法國嘉法獅）、吐溫、親水性辛葵酸甘油酯 （ODO-L）、丙三醇、1，2-丙二醇、聚乙二醇 （PEG400）、大豆油、棕櫚酸異丙酯 （IPP）、肉豆蔻酸異丙酯 （IPM）、辛酸葵酸甘油三酯（GTCC）、油酸乙酯 （均購自廣州銘旺生物科技有限公司）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ （購自廣州銘旺生物科技有限公司，批號B-033-131028，純度≥99.0%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品 （購自廣州銘旺生物科技有限公司，批號B-035-130425，純度≥99.0%）、甲醇、乙腈 （德國默克，色譜純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 油相、乳化劑和助乳化劑對白術(shù)揮發(fā)油的溶解度考察

取1 g白術(shù)揮發(fā)油分別與1 mL的油、乳化劑和助乳化劑共置于離心管中，渦旋30 min，置于37℃的搖床上振搖24 h以達(dá)平衡。以4 000 r/min離心30 m in。取上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，用甲醇稀釋適宜倍數(shù)后，用HPLC測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的量，計算白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在不同油相、乳化劑和助乳化劑中的溶解度（n=3），結(jié)果見表1。

表1 不同組分對白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的溶解度

從上述溶解度試驗結(jié)果可以看出白術(shù)揮發(fā)油在乳化劑RH40中的溶解度較大，故選擇RH40為乳化劑。白術(shù)揮發(fā)油在助乳化劑TranscutolP和PEG400溶解度較大，二者將通過進(jìn)一步篩選。油相IPM、GTCC、LabrafilM1944CS對白術(shù)揮發(fā)油均有較強(qiáng)的溶解能力，有待進(jìn)一步篩選。

2.2 油相的選擇 以RH40為乳化劑，分別以TranscutolP和PEG400為助乳化劑，IPM、GTCC、LabrafilM1944CS為油相，固定乳化劑與助乳化劑的比Km為2，采用微板稀釋法繪制偽三元相圖篩選油相。也就是將乳化劑、助乳化劑、油和水按一定的填充計劃加到96孔板中。具體的做法是：將油和混合乳化劑的混合物從A1200μL，A4190μL………F30μL，減幅為10μL，每個孔做3個復(fù)孔，水則從A10μL，A410μL加到F3200μL增幅為10μL下一個比例以同樣的步驟填充96孔板，將填充好的96孔板置于振板器上振搖30min，使充分混合均勻，然后用多功能酶標(biāo)儀于630 nm測定吸光度。吸光度反映的是溶液的透光性，當(dāng)溶液澄清透明時吸光度很小，溶液渾濁時吸光度變大，突然變大變小的點(diǎn)為臨界點(diǎn)，選擇臨界點(diǎn)繪制偽三元相圖，結(jié)果如圖1所示 （曲線下面積為微乳區(qū)）：

圖1 不同油相所得偽三元相圖

結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論以二乙二醇單乙基醚為助乳化劑還是以聚乙二醇為助乳化劑所得微乳區(qū)均以油酸聚乙二醇甘油酯為油相時最大，故選擇油酸聚乙二醇甘油酯為油相。

2.3 助乳化劑和Km的選擇 以聚氧乙烯氫化蓖麻油為乳化劑，油酸聚乙二醇甘油酯為油相，聚乙二醇400和二乙二醇單乙基醚為助乳化劑，乳化劑與助乳化劑分別按1：1、2：1、3：1、4：1混合均勻，再與油相按1：9、2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2、9：1混合均勻，照“2.2”項方法繪制偽三元相圖，結(jié)果如圖2所示 （曲線下面積為微乳區(qū)）：

結(jié)果可知，無論油酸聚乙二醇甘油酯還是以二乙二醇單乙基醚為助乳化劑時成乳區(qū)均隨Km的增大先增大后減小，Km為3時成乳區(qū)達(dá)最大，故Km取3，同時Km相同時兩者的成乳區(qū)相差不大，PEG400略大，但以PEG400為助乳化劑時形成的微乳黏度較大、易起泡、成本較貴，因此選擇二乙二醇單乙基醚為助乳化劑。

圖2 不同助乳化劑及Km值所得偽三元相圖

2.4 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.4.1 星點(diǎn)設(shè)計 根據(jù)前期預(yù)實驗及單因素考察的結(jié)果，選擇對微乳形成較顯著的3個因素即油相質(zhì)量分?jǐn)?shù) （X1）、乳化劑與助乳化劑的比Km（X2）、混合乳化劑與油的比（X3）做為考察因素，根據(jù)偽三元相圖可以確定X1的范圍為0.05～0.3，X2的范圍為1～4，X3的范圍為1～3.5，采用三因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計優(yōu)化處方，實驗安排見表2。

表2 各因素水平的代碼值及實際物理量

選取20個處方所得乳劑的粒徑Y(jié)1（nm）、外觀評分Y2為效應(yīng)，分別對各因素水平用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行二項式擬和，實驗安排見表3（處方4凝膠現(xiàn)象嚴(yán)重，無法測粒徑，將其剔除），外觀評分是根據(jù)文獻(xiàn)和實驗現(xiàn)象來劃分等級并進(jìn)行評分，具體如下：澄清透明或微泛藍(lán)光，流動性好呈水樣，計1分；澄清透明無藍(lán)光，黏稠，計2分；藍(lán)白色溶液，流動性好，計3分；凝膠狀，幾乎不能流動，計4分；乳白色溶液，計5分。

2.4.2 數(shù)據(jù)模型擬合 采用Design Expert 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二項式擬和，方程如下：Y1=255.574 84+ 2 198.043 64X1-189.013 34X2-101.103 47X3-836.707 36 X1X2+143.754 44X1X3+2 657 422X2X3-446.254 64+ 41.701 01+1.393 45（R2=0.939 9，P＜0.000 2）

表3 星點(diǎn)設(shè)計與實驗結(jié)果

Y2=8.255 94+61.134 00X1-7.200 13X2-1.041 03X1-3.041 75X1X2-9.926 35X1X3+1.058 42X2X3-82.411+ 0.983-0.184（R2=0.958 3，P＜0.000 1）

結(jié)果表明各效應(yīng)與三因素各水平的二項式擬合效果均較好，相關(guān)系數(shù)較大。方程系數(shù)經(jīng)方差分析簡化后相關(guān)系數(shù)均降低，所以未對方程進(jìn)行簡化。

分別將X1、X2、X3固定為0.17、2.5、2.25，繪制另兩個變量對Y1、Y2的效應(yīng)面圖及等高線圖，按照二項式擬合方程描繪各效應(yīng)對因素的效應(yīng)面及等高線圖見圖3。

圖3 粒徑、外觀評分對各因素的效應(yīng)面及等高線圖

由圖可知隨油相比例的增加，粒徑逐漸增大，外觀評分也逐漸增大；當(dāng)油相比例一定時，粒徑和外觀評分均隨Km值的增大先減小后緩慢增大；混合乳化劑與油的比值對粒徑和外觀評分的影響均不大。根據(jù)擬合方程、效應(yīng)面圖及等高線圖，選擇粒徑小、評分低、乳化劑含量低、含油量較高的處方為最優(yōu)處方，確定最優(yōu)處方：X1為0.15，X2為3，X3為2，即聚氧乙烯氫化蓖麻油-二乙二醇單乙基醚-油酸聚乙二醇甘油酯-水比為2.25：0.75：1.5：5.5。

2.4.3 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法的驗證 按優(yōu)化的處方制備微乳，并進(jìn)行粒徑和外觀評分，結(jié)果所得微乳粒徑為21.2 nm，外觀評分為1分，與預(yù)測的粒徑20.07 nm、外觀1.41分很接近，說明模型的預(yù)測性良好。

2.4.4 微乳的制備

2.4.4.1 空白乳的制備 按處方稱取處方量的乳化劑、助乳化劑和油，攪拌均勻，再加入處方量的水于30℃水浴電動攪拌均勻即得。

2.4.4.3 含藥微乳的制備 按照空白處方稱取處方量的乳化劑、助乳化劑和油，攪拌均勻，再加入處方量的水，于30℃水浴中電動攪拌，邊攪拌邊加入白術(shù)揮發(fā)油至不再溶解為止，得到含藥量為7.5%的白術(shù)揮發(fā)油微乳。

2.5 微乳的性狀考察

2.5.1 外觀性狀 空白微乳為淡藍(lán)色澄清透明、流動性好的液體；白術(shù)揮發(fā)油微乳為黃褐色澄清、均一液體。

2.5.2 粒徑及其分布 采用Zetasizer激光粒度儀測得空白乳的粒徑為21.2 nm，多分散指數(shù) （PDI）值為0.224，含藥乳為25 nm，多分散指數(shù) （PDI）值為0.26.結(jié)果如圖4。

圖4 空白微乳 （左）和含藥乳 （右）的粒徑分布

3 討論

微乳的制備目前普遍采用傳統(tǒng)的加水滴定法，雖然簡便易行但視覺判斷帶來很大的誤差，不同的實驗人員所獲得的實驗結(jié)果相差很大，對生產(chǎn)極為不利。本實驗采用改進(jìn)的加水滴定法，該法利用酶標(biāo)儀測定吸光度代替肉眼判斷臨界點(diǎn)，根據(jù)的是光散射原理，該原理認(rèn)為乳劑的濁度越高透光率越小即吸光度值就越大，根據(jù)吸光度值的變化情況就可以找出形成微乳的臨界點(diǎn)，根據(jù)臨界點(diǎn)時各組分的比繪制偽三元相圖。這種方法直觀簡便，且該方法比傳統(tǒng)的加水滴定法更加全面，繪制出的偽三元相圖更可信。

均勻設(shè)計和正交設(shè)計優(yōu)化工藝、篩選處方是用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，雖可減少試驗，但仍有很不足之處：試驗的精度不夠，所選取的僅僅接近最佳值，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性不好。星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計方法于一體，不僅試驗次數(shù)少、精度高，而且采用二次擬合所建立的模型預(yù)測性良好。本試驗在前期的研究中篩選出對處方有顯著影響的3個因素：油相質(zhì)量分?jǐn)?shù) （X1）、乳化劑與助乳化劑的比Km（X2）、混合乳化劑與油的比 （X3）作為考察因素，粒徑、外觀評分作為應(yīng)變量，運(yùn)用Design Expert 8.0軟件繪制效應(yīng)面和等高線圖，根據(jù)效應(yīng)面結(jié)合等高線，篩選最優(yōu)處方。

白術(shù)揮發(fā)油具有良好的抗腫瘤作用，但其易氧化分解、在水中溶解度小，本研究將其制成微乳提高溶解度和穩(wěn)定性，由于微乳粒徑小、易吸收、生物利用度高，將白術(shù)揮發(fā)油制成微乳可提高其生物利用度和藥效。本實驗篩選的最優(yōu)處方具有很高的臨床應(yīng)用價值，可以很好的為臨床服務(wù)。

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R944

B

1001-1528（2015）04-0889-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.046

2014-06-12

山東省科技廳重大項目 （2008GG30002027）；廣東省教育廳課題 （AFD111122A03）

孫林芳 （1988—），女，碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的防治研究工作。Tel：（020）39318470，E-mail：sunlinfang2013@163.com

*通信作者：牟 潔，教授，從事藥劑學(xué)研究工作。Tel：（0531）86305165，E-mail：mujie_111@163.com