楊軍宣， 張 毅， 呂姍珊， 周年華， 幸 忠， 蒲曉東*

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶401121；3.重慶希爾安藥業(yè)有限公司，重慶401121）

超臨界-CO2萃取酸棗仁皂苷類成分的研究

楊軍宣1， 張 毅2， 呂姍珊3， 周年華3， 幸 忠3， 蒲曉東1*

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶401121；3.重慶希爾安藥業(yè)有限公司，重慶401121）

目的研究酸棗仁中皂苷類成分的超臨界-CO2萃取最佳工藝參數(shù)。方法采用單因素考察法，以酸棗仁皂苷A的收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、CO2體積流量、夾帶劑類型及其用量等因素對(duì)萃取效果的影響。并與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取法等進(jìn)行比較研究。結(jié)果超臨界-CO2萃取酸棗仁中皂苷類成分的最佳工藝為：萃取壓力35.0 MPa，萃取溫度45℃，以95%乙醇為夾帶劑，其與藥材投料量比例為1：1（V/W），CO2體積流量6 L/min，循環(huán)萃取時(shí)間3.0 h。結(jié)論超臨界-CO2萃取酸棗仁中皂苷類成分具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，提取效果優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法。

超臨界-CO2萃取；酸棗仁；酸棗仁皂苷A

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujube Mil1.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗、生津的功效，常用于虛煩不眠、驚悸多夢(mèng)、體虛多汗、津傷口渴等癥的治療［1］。酸棗仁主要有效成分為其皂苷類成分，目前報(bào)道的從酸棗仁中提取分離酸棗仁皂苷的方法有水提法、乙醇加熱回流法、大孔吸附樹脂法、正丁醇萃取法、超聲提取法、微波法、復(fù)合酶法［2-8］等。這些傳統(tǒng)方法工藝較繁瑣，流程長(zhǎng)，提取效率較低，能耗高，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，有的方法有機(jī)溶劑用量較大，生產(chǎn)不安全，也可能對(duì)環(huán)境造成污染。

超臨界流體萃取技術(shù)（Supercritical Fluid Extraction，SFE）作為一種現(xiàn)代新型的提取分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的提取分離方法相比具有諸多優(yōu)勢(shì)，如：提取與分離兩個(gè)單元操作合二為一；在較低溫度下操作，適合熱穩(wěn)定性較差的物質(zhì)的提取分離；通過控制溫度、壓力及不同夾帶劑等，可有效提取不同極性的成分；多以CO2作為超臨界流體，無毒，不易燃，廉價(jià)易得，可循環(huán)使用，無溶劑殘留；安全環(huán)保。超臨界流體萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品及香料工業(yè)等領(lǐng)域［9］。酸棗仁皂苷類成分的超臨界萃取工藝目前尚無研究，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酸棗仁中的皂苷類成分的超臨界流體萃取工藝進(jìn)行研究，確立了最佳的工藝流程和條件，為超臨界流體萃取技術(shù)在中藥實(shí)際生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料

Agilent 1200液相色譜儀、Agilent色譜數(shù)據(jù)工作站（美國Agilent公司）；ZAM4000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（天津譜祥科技有限公司）；Phenomenex luna C18色譜柱（4.6 mm× 250mm，5μm；廣州菲羅門公司）；BP211D電子天平 （德國Startorious）；SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；HA121-50-01型超臨界萃取裝置 （江蘇南通華安公司）；LK-600A型高速中藥粉碎機(jī) （浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠）。

乙腈為HPLC色譜純 （德國默克），水為雙蒸水，其余試劑為市售分析純。CO2氣體 （純度＞99.0%，重慶同輝二氧化碳?xì)怏w公司）；酸棗仁皂苷A對(duì)照品 （中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110734-200509，供含量測(cè)定用）。酸棗仁藥材購于四川省成都市荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院蒲曉東教授鑒定為 《中國藥典》2010年版一部收載酸棗仁Ziziphus jujuba Mill.Var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 酸棗仁皂苷A的測(cè)定 HPLC的測(cè)定酸棗仁皂苷A，按 《中國藥典》2010年版一部酸棗仁藥材項(xiàng)下方法［1］操作。酸棗仁皂苷A對(duì)照品及供試品溶液的高效液相色譜圖見圖1。

［10］方法進(jìn)行方法學(xué)考察。以酸棗仁皂苷A進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程lgA=1.52lgC-10.23（r=0.999 8），可知酸棗仁皂苷A在0.2～2.0μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 超臨界CO2萃取工藝

2.2.1 超臨界CO2萃取工藝流程 超臨界CO2萃取示意圖見圖2。將酸棗仁藥材粉碎至約24目，取100 g置超臨界萃取釜中，升溫至設(shè)定溫度；啟動(dòng)泵一，萃取釜升壓至設(shè)定壓力。通過泵二向萃取釜中加入夾帶劑。通過調(diào)節(jié)閥門使分離釜Ⅰ壓力為6 MPa、溫度為45℃，分離釜Ⅱ壓力為5 MPa、溫度為35℃。循環(huán)萃取。萃取結(jié)束后，從分離釜Ⅰ和分離釜Ⅱ得到提取物。

圖1 高效液相色譜圖

圖2 超臨界CO2萃取裝置流程圖

2.2.2 超臨界CO2提取物中酸棗仁皂苷A的測(cè)定 精密取酸棗仁超臨界CO2提取物適量，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，超聲處理5 min使溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算收率。

2.2.3 精密度及回收率考察 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，8 h內(nèi)測(cè)得峰面積RSD為1.33% （n=5）；測(cè)定平均加樣回收率為96.23%，RSD為1.86%（n=6）。

2.2.4 超臨界CO2萃取壓力考察 影響超臨界萃取效果的主要因素有萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、夾帶劑等。首先考察超臨界CO2萃取壓力對(duì)提取效果的影響。以95%乙醇為夾帶劑，其與藥材投料量比例為1：1（V/w），萃取溫度50℃，萃取時(shí)間3 h，CO2體積流量為5 L/min。在15.0～40.0 MPa范圍內(nèi)進(jìn)行超臨界CO2萃取，測(cè)定酸棗仁皂苷A收率。結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，萃取壓力為35.0 MPa即可。

圖3 萃取壓力對(duì)酸棗仁皂苷A收率的影響 （n=3）

2.2.5 超臨界CO2萃取溫度考察 萃取壓力為35.0 MPa，其他萃取條件同 “2.2.4”項(xiàng)。在30～60℃范圍內(nèi)進(jìn)行超臨界CO2萃取，測(cè)定酸棗仁皂苷A收率。結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，萃取溫度為45℃即可。

圖4 萃取溫度對(duì)酸棗仁皂苷A收率的影響 （n=3）

2.2.6 超臨界CO2萃取時(shí)間考察 萃取溫度為45℃，其他萃取條件同 “2.2.5”項(xiàng)。在1～5 h范圍內(nèi)進(jìn)行超臨界CO2萃取，測(cè)定酸棗仁皂苷A收率。結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，萃取時(shí)間為3 h即可。

2.2.7 CO2體積流量考察 萃取時(shí)間為3 h，其他萃取條件同“2.2.6”項(xiàng)。在CO2體積流量為2～20 L/min范圍內(nèi)進(jìn)行超臨界CO2萃取，測(cè)定酸棗仁皂苷A收率。結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，萃取時(shí)CO2體積流量為6 L/min即可。

2.2.8 夾帶劑種類考察 加入夾帶劑，有利于提高超臨界相的極性，從而提高所需提取成分的收率。萃取條件同“2.2.7”項(xiàng)，考察無夾帶劑、甲醇、95%乙醇、正丁醇超臨界CO2萃取效果。結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，不加夾帶劑，酸棗仁皂苷A收率較低，其余三者提取效果相當(dāng)。考慮到安全性和生產(chǎn)成本等，選擇夾帶劑為95%乙醇即可。

圖5 萃取時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷A收率的影響 （n=3）

圖6 CO2體積流量對(duì)酸棗仁皂苷A收率的影響（n=3）

圖7 夾帶劑對(duì)酸棗仁皂苷A收率的影響（n=3）

2.2.9 夾帶劑用量考察 以95%乙醇為夾帶劑，考察不同用量對(duì)酸棗仁皂苷A收率的影響。結(jié)果見圖8。結(jié)果表明，夾帶劑與藥材投料量比例為1：1（v/w）即可。

綜上所述，超臨界CO2萃取酸棗仁皂苷類成分的最佳工藝條件為：萃取壓力為35.0 MPa，萃取溫度為45℃，CO2體積流量為6 L/min，以95%乙醇為夾帶劑，其與藥材投料量比例為1：1（V/w），循環(huán)萃取3 h即可。

2.3 超臨界CO2萃取法與傳統(tǒng)提取純化方法的對(duì)比 目前提取皂苷類成分的通法為正丁醇萃取法［4］，其他具有代表性的提取分離方法有大孔吸附樹脂法 （藥材加水煎煮，水提液濃縮后乙醇沉淀處理，濾液回收乙醇，濃縮至1.0 g/m L，上大孔吸附樹脂柱，70%乙醇洗脫，速度2 BV/h，用量4 BV）［5］。本實(shí)驗(yàn)取500 g藥材，比較了上述兩種方法與超臨界CO2萃取法的提取效果，結(jié)果見表1。

在此階段，因受到“反右”運(yùn)動(dòng)、“大躍進(jìn)”、“文革”等政治活動(dòng)和自然災(zāi)害的影響，農(nóng)業(yè)推廣體系受到了嚴(yán)重的沖擊，農(nóng)業(yè)推廣工作也處于停滯狀態(tài)。在此期間，農(nóng)業(yè)推廣工作呈現(xiàn)跌宕起伏的特點(diǎn)。

圖8 夾帶劑用量對(duì)酸棗仁皂苷A收率的影響 （n=3）

表1 超臨界CO2萃取法與傳統(tǒng)提取純化方法的對(duì)比研究結(jié)果

結(jié)果表明，超臨界CO2萃取酸棗仁皂苷成分的收率明顯高于正丁醇提取法及大孔吸附樹脂法，產(chǎn)品純度與正丁醇提取法相當(dāng)，均明顯高于大孔吸附樹脂法 （2倍及以上）；且超臨界CO2萃取的提取時(shí)間及溫度明顯低于后二者。綜合分析，超臨界CO2萃取法提取效果優(yōu)于正丁醇提取法及大孔吸附樹脂法。

3 討論

中藥有效成分提取分離過程是制約中藥發(fā)展的瓶頸，是中藥生產(chǎn)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作為一種新型的提取分離技術(shù)，超臨界萃取技術(shù)已被大量應(yīng)用于中藥的研究開發(fā)。酸棗仁皂苷類成分的超臨界提取工藝目前尚無研究，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酸棗仁中的皂苷類成分的超臨界流體萃取工藝進(jìn)行研究。結(jié)果表明，超臨界CO2萃取提取工藝簡(jiǎn)單，時(shí)間短，效率高，能耗少，安全環(huán)保，優(yōu)于常規(guī)提取方法。

文獻(xiàn)報(bào)道，原料不同預(yù)處理方法 （粉碎、軋胚等）可有效地破壞細(xì)胞組織，增大表面積，降低萃取所需滲透壓，提高萃取率［11］；對(duì)于皂苷類物質(zhì)的萃取，添加表面活性劑有時(shí)能提高得率，如在夾帶劑中加入表面活性劑 （吐溫-80、司盤-80等）進(jìn)行混合萃取，可明顯提高提取物得率［12］；超聲強(qiáng)化超臨界CO2萃取與單純超臨界CO2萃取相比較，能明顯縮短萃取時(shí)間，降低萃取溫度，提高萃取產(chǎn)物得率 （約1.6倍）［13］。上述因素對(duì)超臨界CO2萃取酸棗仁皂苷的提取效果的影響有待進(jìn)一步深入研究。

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R284.2

B

1001-1528（2015）04-0889-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.048

2014-02-20

重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目 （ZY20132025）

楊軍宣（1974—），男，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?。Tel：（023）65712064，E-mail：yjxhawk@sina.com

*通信作者：蒲曉東（1959—），男，碩士，教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量及方劑研究。E-mail：pxdq@yahoo.com.cn