■宋志元 劉 建 劉三俠 儲(chǔ) 君 張要齊

（河南惠通天下動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河南鄭州 450008）

隨著抗生素飼料添加劑廣泛使用，人們也逐漸認(rèn)識(shí)到抗生素帶來的弊端，并呼吁開發(fā)綠色飼料添加劑替代抗生素。因此，世界各國對(duì)新型綠色飼料添加劑的研究與應(yīng)用十分重視[1]，其中，微生態(tài)制劑是目前研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。微生態(tài)制劑通過維持腸道內(nèi)微生態(tài)平衡[2]、產(chǎn)生有益代謝物[3]而發(fā)揮作用，具有防治疾病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)生長、增加體重等多種功能，且無污染、無殘留、不產(chǎn)生抗藥性，可作為抗生素的替代品應(yīng)用于飼料添加劑中。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是單細(xì)胞微生物，屬于真菌類，耐酸性強(qiáng)[4]?；钚愿山湍?、酵母培養(yǎng)物、酵母提取物、酵母細(xì)胞壁等都是我國農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》(2008)所允許使用的飼料添加劑。本文對(duì)釀酒酵母液體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期提高釀酒酵母的產(chǎn)量，為以后規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 菌種

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，河南惠通天下動(dòng)物藥業(yè)有限公司微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 培養(yǎng)基

改良馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、K2HPO40.1%、MgSO40.05%，pH值6.0。檢測(cè)培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基中加1.5%瓊脂粉。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%、蛋白胨2%、KH2PO40.1%、K2HPO41.0%、MgSO4·7H2O 0.1%、NaCl 0.1%。

2 方法

2.1 釀酒酵母生長曲線的繪制

將斜面菌種或種子液接種至培養(yǎng)基中，振蕩速率為150 r/min，30℃振蕩培養(yǎng)。從接種后0 h開始，每2 h取一次樣，檢測(cè)發(fā)酵液在660 nm處的吸光度，繪制生長曲線。

2.2 碳源及添加量的確定

分別以5%的葡萄糖、紅砂糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作為碳源添加至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，根據(jù)發(fā)酵情況確定優(yōu)選碳源。然后分別將5.0%、10.0%、15.0%和20.0%的優(yōu)選碳源添加至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵。

2.3 氮源及添加量的確定

分別以2%的氯化銨、硫酸銨、磷酸氫二銨、尿素、檸檬酸銨、蛋白胨和酵母粉作為氮源添加至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，根據(jù)發(fā)酵情況確定優(yōu)選氮源。然后分別將2.0%、4.0%、6.0%和8.0%的優(yōu)選氮源添加至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵。

2.4 碳氮源正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)碳氮源單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行碳氮源正交優(yōu)化試驗(yàn)，精確碳氮源的添加量。

2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

分別對(duì)發(fā)酵初始pH值（5.5、6.0、6.5和7.0）、裝液量(50、75、100、125 ml/500 ml)、接種量（2.5%、5.0%、7.5%和10%）、振蕩速率（0、75、150、180 r/min）和溫度（24、27、30、33、36 ℃）進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 釀酒酵母生長曲線

種子液中釀酒酵母的生長曲線（見圖1A）表明，0～12 h為生長延滯期，12～24 h為生長對(duì)數(shù)期，24 h后為穩(wěn)定期，確定22～24 h為最佳種齡。發(fā)酵液中釀酒酵母的生長曲線表明（見圖1B），生長延滯期較短，發(fā)酵14 h后就進(jìn)入了生長穩(wěn)定期，確定16 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖1 釀酒酵母生長曲線

3.2 碳源及添加量對(duì)發(fā)酵的影響

分別以葡萄糖、紅砂糖、乳糖、玉米粉和淀粉為唯一碳源的發(fā)酵結(jié)果顯示（見圖2A），葡萄糖和紅砂糖的發(fā)酵活菌數(shù)較高，而乳糖、玉米粉和淀粉的發(fā)酵活菌數(shù)極低。不同添加比例的葡萄糖發(fā)酵活菌數(shù)也不相同，其中10.0%葡萄糖發(fā)酵獲得較高的活菌數(shù)（見圖2B）。

圖2 碳源及添加量對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響

3.3 氮源及添加量對(duì)發(fā)酵的影響

分別以無機(jī)氮源（氯化銨、磷酸氫二銨、硫酸銨、檸檬酸銨和尿素）和有機(jī)氮（蛋白胨和酵母粉）為唯一氮源的發(fā)酵結(jié)果顯示（圖3A），蛋白胨和酵母粉有利于釀酒酵母的生長及增殖，活菌數(shù)較高；而無機(jī)氮源不利于釀酒酵母的生長及增殖，活菌數(shù)較低。蛋白胨添加量為4.0%時(shí)，發(fā)酵活菌數(shù)高于其它添加量（見圖3B）。

圖3 氮源及添加量對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響

3.4 碳氮源正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)碳氮源單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，以釀酒酵母發(fā)酵活菌數(shù)為指標(biāo)，對(duì)葡萄糖、紅砂糖、蛋白胨和酵母粉進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)（試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1）。正交試驗(yàn)結(jié)果表明（見表2），從各因素對(duì)發(fā)酵活菌數(shù)影響的顯著性上來看，蛋白胨＞葡萄糖＞酵母粉＞紅砂糖；最佳組合為A3B3C1D2，即葡萄糖12.0%、紅砂糖2.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉1.0%。此培養(yǎng)基配方條件下，進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵液活菌數(shù)為5.01×108cfu/ml。

3.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

3.5.1 初始pH值對(duì)發(fā)酵的影響(見圖4)

由圖4可以看出，不同初始pH值導(dǎo)致發(fā)酵活菌數(shù)不同，初始pH值為6.0時(shí)，發(fā)酵活菌數(shù)高于其它的初始pH值發(fā)酵活菌數(shù)，確定最佳初始pH值為6.0。

表1 碳源和氮源優(yōu)化的正交試驗(yàn)因素和水平

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

圖4 初始pH值對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響

3.5.2 裝液量對(duì)發(fā)酵的影響(見圖5)

圖5結(jié)果顯示，隨著裝液量的增加，發(fā)酵活菌數(shù)則降低，說明充分溶氧有利于釀酒酵母的生長及增殖；裝液量分別為50 ml/500 ml和75 ml/500 ml時(shí)，發(fā)酵活菌數(shù)差異不顯著，確定最佳裝液量為75 ml/500 ml。

3.5.3 接種量對(duì)發(fā)酵的影響(見圖6)

由圖6可知，當(dāng)接種量或大、或小時(shí)，都不利于釀酒酵母的生長及增殖。相較于其他接種量，5.0%的接種量可獲得較高的活菌數(shù)，因此確定最佳接種量為5.0%。

3.5.4 振蕩速率對(duì)發(fā)酵的影響(見圖7)

圖7結(jié)果表明，靜置發(fā)酵最不利于釀酒酵母的增殖，隨著振蕩速率的提高，發(fā)酵活菌數(shù)也大幅提高；結(jié)合“3.5.2”試驗(yàn)結(jié)果，表明提高溶氧，有利于釀酒酵母的生長及增殖。確定最佳振蕩速率為180 r/min。

圖5 裝液量對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響

圖6 接種量對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響

圖7 振蕩速率對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響

3.5.5 溫度對(duì)發(fā)酵的影響(見圖8)

由圖8可以看出，發(fā)酵活菌數(shù)隨著溫度的升高，先升高后降低，在溫度為30℃時(shí)，釀酒酵母活菌數(shù)達(dá)到最高，說明該溫度為釀酒酵母最適生長溫度，確定釀酒酵母的發(fā)酵溫度為30℃。在初始pH值6.0、裝液量75 ml/150 ml、接種量5.0%、振蕩速率180 r/min、發(fā)酵溫度30℃等最佳發(fā)酵條件下，進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵液活菌數(shù)為5.8×108cfu/ml，比優(yōu)化前(2.0×108cfu/ml)提高了1.9倍。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響

4 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)釀酒酵母的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖12.0%、紅砂糖2.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉1.0%、KH2PO40.1%、K2HPO41.0%、MgSO4·7H2O 0.1%、NaCl 0.1%。在初始pH值6.0、裝液量75 ml/500 ml、接種量5.0%、振蕩速率180 r/min、發(fā)酵溫度30℃等條件下，釀酒酵母活菌數(shù)有了明顯的提高，達(dá)到5.8×108cfu/ml，比優(yōu)化前提高了1.9倍。