劉國良 于英君 姚 遠(yuǎn) 姜 穎 張 寧 張明磊 高海娜 李建民

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040

黃褐斑俗稱蝴蝶斑，是黑素細(xì)胞（melanocytes，MC）合成黑素量過多蓄積于皮膚而形成的，研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)雌激素水平與黃褐斑的發(fā)病關(guān)系密切，雌激素與雌激素受體結(jié)合可影響黑素細(xì)胞增殖、黑素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶（TYR）的活性及數(shù)量，從而影響黑素合成，是導(dǎo)致色素沉著的主要因素[1-4]。在天然植物中發(fā)現(xiàn)許多有弱雌激素樣作用化合物， 可與雌激素受體（ER）相結(jié)合發(fā)揮雌激素樣作用， 用于治療激素相關(guān)疾病。植物雌激素又被稱為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，其雌激素活性較雌二醇低，表現(xiàn)出具有類雌激素或抗雌激素效應(yīng)，故而在體內(nèi)具有較溫和的雙向調(diào)節(jié)作用[5-7]。植物雌激素與ER 結(jié)合后，刺激性激素結(jié)合球蛋白的產(chǎn)生，并抑制TYR 和雌激素合成酶的活性，從而減輕雌激素促細(xì)胞增殖的作用，而植物雌激素在黑素合成過程中發(fā)揮怎樣的作用，以及其是如何通過ER 信號通路進(jìn)行調(diào)控的還不得而知。本研究選用補(bǔ)骨脂中的植物雌激素成分補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚作用于人黑素瘤細(xì)胞（A375 細(xì)胞），研究其對ER、MAPK 信號通路蛋白激酶表達(dá)的影響，闡明植物雌激素成分干預(yù)黑素合成的作用機(jī)制，為合理利用中藥植物雌激素防治黃褐斑等皮膚色素沉著類疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（南京澤朗科技有限公司，批號：20130821）；HRP 標(biāo)記羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司，生產(chǎn)批號：BST08k13B）；小鼠抗人JNK 單克隆抗體（生產(chǎn)批號：#G0913）；ER 阻斷劑（ICI182780）（TOCRIS 公司，批號：20A/129473）；JNK 抑制劑（SP600125）（美國Selleck 公司，批號：S110202）。

1.2 細(xì)胞分組

將對數(shù)期生長的A375 細(xì)胞，以105每孔接種到6 孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)分為空白組（加入2 mL DMEM 完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h）、雌二醇組（A375 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，加入雌二醇濃度為10-3μmol/L 的2 mL DMEM 完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組（A375 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚2 mL 的DMEM 完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h）、ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組（先加2 mL 的ICI182780培養(yǎng)2 h 后， 再加1 mL 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚，繼續(xù)培養(yǎng)48 h）、SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組 （先加2 mL 的SP600125 培養(yǎng)2 h 后，再加1 mL 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚，繼續(xù)培養(yǎng)48 h）。

1.3 MTT 檢測

細(xì)胞培養(yǎng)72 h 至結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL 濃度為5 g/L 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，除去上清液，每孔加入150 μL DMSO，將96 孔板置于37℃恒溫震蕩培養(yǎng)器內(nèi)震蕩10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解。 酶標(biāo)儀490 nm 波長處測定吸光度。

1.4 黑素含量

將對數(shù)期A375 細(xì)胞以細(xì)胞濃度105個(gè)/孔接種于6 孔板，各組細(xì)胞均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，按分組給藥。酶標(biāo)儀490 nm 波長處測定吸光度。

1.5 TYR 活性

將對數(shù)期A375 細(xì)胞以細(xì)胞濃度5000 個(gè)/孔接種于96 孔板，每孔200 μL DMEM 完全培養(yǎng)液，各組細(xì)胞均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。酶標(biāo)儀490 nm 波長處測定吸光度。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1.6.1 總RNA 提取 細(xì)胞總RNA 的提取按照試劑盒說明操作。 引物設(shè)計(jì)：引物的設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供， 以β-actin 為內(nèi)參照，引物序列見表1。1.6.2 PCR 擴(kuò)增 在冰水浴上的PCR 管中依次加入16.1 μL ddH2O、1.5 μL cDNA、2.5 μL 10×PCR Buffer、2.5 μL dNTP、1.3 μL MgCl2，最后加入0.1 μL Taq 酶，上游引物和下游引物各0.5 μL， 使PCR 管內(nèi)終體積達(dá)到25 μL。將PCR 管放入PCR 擴(kuò)增儀上，PCR 擴(kuò)增程序見表2。

表1 引物序列

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)

蛋白樣品制備： 當(dāng)細(xì)胞呈80%以上融合時(shí)，WIP組織細(xì)胞裂解液裂解提取總蛋白。 SDS-PAGE 電泳：按照BIO-RAD 公司說明書安裝SDS 聚丙烯酰胺凝膠玻璃板，分別灌制分離膠和濃縮膠。加樣：各40 μL 蛋白樣品。電泳：起始電壓為100 V，電泳10～20 min 后，藍(lán)色染料進(jìn)入分離膠，則電壓升高到120 V，電泳至指示染料到距分離膠底部緣時(shí)1.0～0.5 cm 處時(shí)，停止電泳。 轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)，150 V 轉(zhuǎn)移130 min。 封閉：將轉(zhuǎn)膜后的PVDF 膜浸入盛有封閉液密閉小盒中，室溫封閉1 h。 一抗孵育稀釋比例均為1∶300，4℃過夜。 二抗孵育：二抗（二抗稀釋比例為1∶3500），室溫1 h。 顯影：ECL 顯影液顯影。

表2 擴(kuò)增程序

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），用Tamhane 法進(jìn)行方差齊檢驗(yàn)，LSD 法和SNK 法對數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞活性的影響

與空白組比較，10-3μmol/L 的雌二醇組對細(xì)胞活性的作用無顯著性差異（P ＞0.05）；10、100 μmol/L 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對細(xì)胞的活性有顯著的抑制作用（P ＜0.01），1、10-1、10-2、10-3μmol/L 的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對A375 細(xì)胞活性均無顯著作用（P ＞0.05）。見表3。

表3 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞活性的影響（±s，n = 6）

表3 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞活性的影響（±s，n = 6）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 濃度（μmol/L） 吸光度空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-3 10-2 10-1 1 10 100 0.368±0.021 0.366±0.023 0.368±0.026 0.365±0.025 0.363±0.024 0.356±0.024 0.314±0.020**0.108±0.028**

2.2 ICI182780/SP600125 +補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞黑素合成的影響

與空白組比較，雌二醇組對黑素合成有顯著的促進(jìn)作用，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組和SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對黑素合成有顯著的抑制作用，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組和SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對黑素合成有上調(diào)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表4。

表4 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞黑素合成的影響（±s，n = 5）

表4 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞黑素合成的影響（±s，n = 5）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，#P ＜0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 濃度（mol/L） 吸光度空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780 +補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組SP600125 +補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 10-6 0.079±0.004 0.108±0.014**0.039±0.002**0.051±0.001**#0.048±0.006**#

2.3 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞TYR 活性的影響

與空白組比較，雌二醇組能顯著提高TYR 活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對TYR 活性有顯著的抑制作用（P ＜0.01）。 與 補(bǔ) 骨 脂 二 氫 黃 酮 甲 醚 組 比 較，ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組均能顯著提高TYR 活性， 差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 見表5。

表5 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞TYR 活性的影響（±s，n = 5）

表5 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞TYR 活性的影響（±s，n = 5）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，##P ＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)；TYR：酪氨酸酶

組別 濃度（mol/L） 吸光度空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 10-6 0.078±0.003 0.112±0.014*0.041±0.002**0.059±0.004**##0.056±0.004**##

2.4 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞mRNA 的影響

與空白組比較， 雌二醇組各指標(biāo)mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組下調(diào)TYR、TRP-1/2、ERK1/2、JNK2 mRNA 表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組減弱了補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚下調(diào)mRNA 表達(dá)的作用，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表6。

2.5 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞mRNA 表達(dá)的影響

與空白組比較，雌二醇組各指標(biāo)mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組能明顯降低TYR、TRP-1/2、ERK1/2、JNK2 mRNA 的表達(dá)， 差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）； 與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組下調(diào)TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA 表達(dá)的作用均被減弱，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見表7。

表6 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞mRNA 的影響（±s，n = 4）

表6 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞mRNA 的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 濃度（mol/L） TYR/β-actin TRP-1/β-actin TRP-2/β-actin ERK1/β-actin ERK2/β-actin JNK2/β-actin空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 0.490±0.026 0.546±0.022**0.254±0.023**0.282±0.002##0.405±0.018 0.485±0.017**0.069±0.005**0.187±0.018##0.453±0.027 0.544±0.023**0.207±0.028**0.374±0.002##0.496±0.017 0.674±0.021**0.312±0.029**0.534±0.024##0.564±0.033 0.770±0.022**0.344±0.028**0.397±0.018#0.444±0.013 0.565±0.025**0.228±0.023**0.034±0.019##

表7 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞mRNA 表達(dá)的影響（±s，n = 4）

表7 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對A375 細(xì)胞mRNA 表達(dá)的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 濃度（mol/L） TYR/β-actin TRP-1/β-actin TRP-2/β-actin ERK1/β-actin ERK2/β-actin JNK2/β-actin空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 0.436±0.016 0.529±0.021**0.189±0.020**0.224±0.023#0.477±0.018 0.502±0.022*0.234±0.028**0.289±0.018#0.455±0.018 0.563±0.022**0.337±0.018**0.404±0.028#0.584±0.022 0.663±0.026**0.454±0.028**0.497±0.017#0.414±0.018 0.495±0.023**0.288±0.019**0.366±0.018##0.468±0.022 0.782±0.012**0.255±0.032**0.356±0.015##

2.6 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較， 雌二醇組能顯著增強(qiáng)TYR、JNK蛋白的表達(dá) （P ＜0.01）； 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組極顯著下調(diào)TYR、JNK 蛋白表達(dá)（P ＜0.01）。 與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組減弱了補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚下調(diào)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的作用（P ＜0.01）。 見表8、圖1。

2.7 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，雌二醇組TYR、JNK 蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P ＜0.01）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組極顯著下調(diào)TYR、JNK 蛋白表達(dá)（P ＜0.01）。 與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組減弱補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚下調(diào)TYR、JNK2 蛋白表達(dá)作用（P ＜0.01）。 見表9、圖2。

3 討論

在人皮膚黑素合成過程中不僅受TYR 及其相關(guān)蛋白調(diào)控，還受ER 信號通路以及細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號通路ER-MAPKs 的調(diào)控[8-10]。 在黃褐斑患者的皮膚中發(fā)現(xiàn)，ER 的表達(dá)與色斑的嚴(yán)重程度有著密切的關(guān)系[11-13]。

表8 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 4）

表8 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，##P ＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)；TYR：酪氨酸酶

組別 濃度（mol/L） TYR/β-actin JNK/β-actin空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 0.105±0.002 0.140±0.002**0.064±0.004**0.091±0.003**##0.099±0.002 0.129±0.011**0.061±0.019**0.075±0.002**##

圖1 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響

ER 是存在于靶器官細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)分子，可與雌激素發(fā)生特異性結(jié)合而形成雌激素-受體復(fù)合物，使雌激素發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞增殖以及參與調(diào)控體內(nèi)多種物質(zhì)代謝過程中起重要作用。目前已確定在真核細(xì)胞中有4 條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：ERK 通 路、JNK 通 路、p38 通 路 和ERK5 通 路。ERK、JNK、P38MAPK 均由相鄰的蘇氨酸 （THR）和TYR 殘基雙磷酸化而激活，介導(dǎo)細(xì)胞生長、發(fā)育、分化及死亡全過程。激活細(xì)胞增殖及分化的信號調(diào)控因子ERK，可引起MITF 磷酸化降解，TYR 活性降低，導(dǎo)致黑素合成減少。JNK 通路可以通過降低cAMP 應(yīng)答原件結(jié)合蛋白 （CREB） 的磷酸化水平， 抑制MITF 和TYR 的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制黑素生成的作用。p38MAPK 信號通路參與了黑素的合成過程，它通過上調(diào)酪氨酸酶基因的表達(dá)來發(fā)揮促進(jìn)黑素合成的作用[14-16]。 骨脂素可增加T47D 細(xì)胞雌激素效應(yīng)基因PR mRNA 的表達(dá)，且促增殖和誘導(dǎo)PR 表達(dá)增強(qiáng)的效應(yīng)均可被雌激素受體拮抗劑ICI182780 所拮抗[17-20]。

表9 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 4）

表9 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，##P ＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)

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圖2 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響

本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚均能顯著抑制黑素合成和TYR 活性，而這種抑制作用可被經(jīng)典ER 受體阻斷劑及JNK 受體阻斷劑所逆轉(zhuǎn)。 補(bǔ)骨脂二氫 黃 酮 甲 醚 能 顯 著 下 調(diào)TYR、TRP-1、TRP-2 及ERK1/2、JNK2 mRNA 的表達(dá)；TYR、JNK 的蛋白表達(dá)也明顯下降；基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的下調(diào)同樣被經(jīng)典ER 受體阻斷劑和JNK 受體阻斷劑所削弱。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測植物雌激素補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚下調(diào)黑素合成的機(jī)制，可能是植物雌激素與雌激素膜受體結(jié)合啟動第二信使系統(tǒng)， 激活了ERMAPK 關(guān)鍵蛋白激酶ERK、JNK 信號通路而發(fā)揮了間接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，使TYR 活性、TYR 及相關(guān)蛋白酶表達(dá)降低來達(dá)到抑制黑素合成的作用。 因此，本實(shí)驗(yàn)表明植物雌激素補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚具有抑制黑素合成的作用，為黃褐斑的治療提供了一種新的藥物開發(fā)可能性， 而其治療黃褐斑的藥物機(jī)制可能是通過ER-MAPK 信號通路起作用，也為植物雌激素藥物的開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1] 周春英，馬秋華，徐逢春.黃褐斑的研究進(jìn)展[J].青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，41（6）：431-435.

[2] Shu YY，Maibach HI. Estrogen and skin：therapeutic options [J]. Am J Clin Dermatol，2011，12（5）：297-311.

[3] Emmerson E，Hardman MJ. The role of estrogen deficiency in skin ageing and wound healing [J]. Biogerontology，2011，3（4）：352-361.

[4] Gold SM，Voskuhl RR. Estrogen and testosterone therapies in multiple sclerosis [J]. Prog Brain Res，2009，175：239-251.

[5] de Giorgi V，Mavilia C，Massi D，et al. The role of estrogens in melanoma and skin cancer [J]. Carcinogenesis，2009，30（4）：720.

[6] Mancuso M，Gallo D，Leonardi S，et al. Modulation of basal and squamous cell carcinoma by endogenous estrogen in mouse models of skin cancer [J]. Carcinogenesis，2009，30（2）：340-347.

[7] Ng LT，Lin LT，Chen CL，et al. Anti-melanogenic effects of δ-tocotrienol are associated with tyrosinase-related proteins and MAPK signaling pathway in B16 melanoma cells [J].Phytomedicine，2014，21（3）：978-983.

[8] 姜澤群.幾種中藥有效成分促黑色素生成的機(jī)制研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2009.

[9] Bu J，Ma PC，Chen ZQ，et al.Inhibition of MITF and tyrosinase by paeonol-stimulated JNK/SAPK to reduction of phosphorylated CREB[J].Am J Chin Med，2008，36（2）：245-263.

[10] Lim SH，Ha TY，Ahn J，et al. Estrogenic activities of Psoralea corylifolia L.seed extracts and main constituents[J].Phytomedicine，2011，18（5）：425-430.

[11] Xin D，Wang H，Yang J，et al. Phytoestrogens from Psoralea corylifolia reveal estrogen receptor-subtype selectivity [J]. Phytomedicine，2010，17（2）：126-131.

[12] ZhaoE，MuQ.Phytoestrogenbiologicalactionsonmammalian reproductive system and cancer growth [J]. Sci Pharm，2011，79（1）：1-20.

[13] 肖艷，劉禎，鄧燕.復(fù)方中藥治療黃褐斑的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18（9）：1056-1058.

[14] Xu Y，Zhang Z，Geng F，et al.Treatment with qing'e，a kidney invigorating Chinese herbal formula，antagonizes the estrogen decline in ovariectomized mice[J].Mary Ann Liebert，2010，13（4）：497-488.

[15] Jang JY，Kim HN，Kim YR，et al. Partially purified components of Nardostachys chinensis suppress melanin synthesis through ERK and Akt signaling pathway with cAMP down-regulation in B16F10 cells [J]. J Ethnopharmacol，2011，137（3）：1207-1214.

[16] 趙丕文，牛見昭，王繼峰，等.補(bǔ)骨脂素的植物雌激素作用及其機(jī)制探討[J].中國中藥雜志，2008，33（1）：59-62.

[17] Tang JY，Spaunhurst KM，Chlebowski RT，et al.Menopausal hormone therapy and risks of melanoma and nonmelanoma skin cancers：women's health initiative randomized trials[J].Natl Cancer Inst，2011，103（19）：1469-1475.

[18] 張寧，劉慧，張明磊，等.逍遙散有效部位對A375 與HacaT 細(xì)胞共培養(yǎng)模型的TYR 及其相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響[J].中藥材，2014，37（6）：1039-1043.

[19] 簡丹.己烯雌酚對黑素合成的影響及機(jī)制研究[D].長沙：中南大學(xué)，2011.

[20] 趙玲玲，張理平.抑制酪氨酸酶藥物研究新進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2009，21（12）：124-126.