艾月琴 趙 華 江龍委 賈紹昌

解放軍第八一醫(yī)院腫瘤生物治療科，江蘇南京 210002

腎癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病。大多數(shù)晚期腎癌對放化療不敏感，且預(yù)后較差[1]。細(xì)胞免疫治療對腫瘤的生物治療取得了良好效果，并逐漸成為腫瘤治療的重要手段之一。近年細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer，CIK）的免疫功能得到廣泛研究。CIK 細(xì)胞作為一種新型的廣譜抗腫瘤免疫細(xì)胞，不僅具有強(qiáng)大的廣譜抗腫瘤效應(yīng)，而且可以調(diào)節(jié)增強(qiáng)腫瘤患者的免疫功能[2-5]。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是特異性免疫的始動者，能將抗原呈遞給免疫效應(yīng)細(xì)胞，據(jù)文獻(xiàn)報道可以增強(qiáng)CIK 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[6-7]。 索拉菲尼（Sorafenib）是一種選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖和組織中腫瘤學(xué)血管生成的多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物，可同時抑制絲氨酸/蘇氨酸和受體酪氨酸激酶，具有良好的抗腫瘤活性[8]。本研究小組進(jìn)行了自體DCCIK 細(xì)胞聯(lián)合索拉非尼治療24 例晚期腎癌患者，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011 年12 月～2014 年3 月解放軍第八一醫(yī)院行自體DC-CIK 聯(lián)合索拉菲尼治療的晚期腎癌患者24 例。所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診為腎癌，其中透明細(xì)胞癌18 例，顆粒細(xì)胞癌4 例，乳頭狀細(xì)胞癌2 例。24 例患者中男14 例，女10 例，年齡27～71 歲，中位年齡為57 歲。 所有患者均為晚期腎癌， 其中肺轉(zhuǎn)移22 例，肝轉(zhuǎn)移4 例，骨轉(zhuǎn)移14 例，腦轉(zhuǎn)移2 例，其他12 例。 其中15 例為術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，病灶轉(zhuǎn)移均2 處及以上。 卡氏評分（KPS）＜80 分16 例，≥80 分8 例。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：懷孕及哺乳期婦女；患有自身免疫性疾病；感染活動狀態(tài)；嚴(yán)重凝血異常；既往有生物制品過敏者。所有臨床試驗(yàn)程序均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，全部受試患者均簽署自體免疫細(xì)胞治療知情同意書。

1.2 DC 及CIK 細(xì)胞的制備及回輸方法

對患者行單個核細(xì)胞采集， 采集終產(chǎn)品經(jīng)Ficoll密度梯度離心法離心， 吸取中間白色分層， 洗滌、計數(shù)，鋪入75 cm2培養(yǎng)瓶，加X-VIVO 培養(yǎng)液至濃度為2×106/mL，搖勻，平放于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 h，待貼壁細(xì)胞貼壁后，吸取上清，將其中的懸浮細(xì)胞用于CIK 培養(yǎng)， 剩下的貼壁細(xì)胞進(jìn)行DC 培養(yǎng)。DC 制備：在貼壁細(xì)胞瓶中加入含重組人粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）（500 U/mL）及重組人白細(xì)胞介素4（rhIL-4）（10 ng/mL）的X-VIVO 培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第3 天、第5 天半量換液，第6 天加入負(fù)荷抗原（與患者病理組織學(xué)相近的同種異體腫瘤細(xì)胞株裂解物）， 第7 天加入腫瘤壞死因子α（TNF-α）（500 U/mL），第8 天收獲腫瘤抗原致敏的DC 疫苗，-80℃冰箱凍存。 治療當(dāng)天將DC 細(xì)胞復(fù)蘇， 復(fù)蘇的DC 細(xì)胞置于20 mL 生理鹽水中備用。 CIK 制備： 將懸浮細(xì)胞按1×106/mL 置于含GTT551 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中， 內(nèi)含終濃度1000 U/mL 的重組人γ 干擾素（rhIFN-γ）；孵育24 h 后加入終濃度500 U/mL 的重組人白細(xì)胞介素2（rhIL-2）和50 ng/mL的anti-CD3 mAb 繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d 補(bǔ)液1 次，保持細(xì)胞密度在（1～2）×106/mL，適時分瓶培養(yǎng)。 觀察細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)量、狀態(tài)及成熟度，在細(xì)胞成熟后收集細(xì)胞。收集的CIK 細(xì)胞置于100 mL 生理鹽水中備用。

1.3 治療方法

患者行單個核細(xì)胞采集后第2 天行索拉非尼治療，400 mg/次，2 次/d， 若無明顯不良反應(yīng)則連續(xù)服用。 外周血單個核細(xì)胞（PBMC）采集后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1 周后進(jìn)行DC 細(xì)胞淋巴結(jié)區(qū)皮下注射，1 次/周，共4 次；PBMC 采集后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)8～10 d，進(jìn)行CIK 細(xì)胞靜脈回輸，隔天1 次，共3 次。 每次回輸DC 細(xì)胞不少于1×107，CIK 細(xì)胞不少于1×109。 4 次DC 治療加3 次CIK 治療為1 個周期。 每間隔1 個月重復(fù)DC-CIK 細(xì)胞治療1 個周期， 每位患者至少行1 個周期的DCCIK 細(xì)胞治療。 治療期間白細(xì)胞計數(shù)＜3×109/L 或肝功能異常者停藥8 周后進(jìn)行評價，對藥物反應(yīng)性好及可耐受者停藥休息2～4 周繼續(xù)下1 個周期治療。在治療前1 個月內(nèi)行CT 檢查，每2 個月行CT 檢查1 次。

1.4 淋巴細(xì)胞亞群檢測

每次DC-CIK 治療前及治療結(jié)束后檢測患者的外周抗凝血， 分三組加入流式抗體， 第一組CD3-ECD、CD4-PC5、CD8-FITC；第二組CD4-PC5、CD25-PE；孵育20 min 后加入紅細(xì)胞裂解液繼續(xù)孵育10 min；低速離心機(jī)中離心，離心機(jī)半徑13.5 cm，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心5 min 后PBS 洗滌2 次，制成單細(xì)胞懸液后上機(jī)檢測，檢測結(jié)果用CXP（v2.1）軟件分析。不同淋巴細(xì)胞亞群的標(biāo)記如下：總T 細(xì)胞（CD3+）、輔助性T 細(xì)胞Th （CD3+CD4+）、 細(xì)胞毒性T 細(xì)胞Tc（CD3+CD8+）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞Treg（CD4+CD25+）。

1.5 療效與安全性評價

在患者接受完最后1 次細(xì)胞治療后1 個月進(jìn)行免疫反應(yīng)及臨床療效評估， 在治療后3 個月再次評估，之后每3～6 個月復(fù)查評估。 近期療效評估按實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）分為完全緩解（complete remission，CR）、部分緩解（partial remission，PR）、病情穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease，PD），患者至少4 周以后進(jìn)行療效確認(rèn)。 以CR+PR 計算治療有效率（response rate，RR），以CR+PR+SD 計算疾病控制率（disease control rate，DCR）。 生活質(zhì)量評價根據(jù)患者KPS 評分：KPS 增加≥10 分為改善；變化＜10 分為穩(wěn)定，減少≥10 分為降低。 不良反應(yīng)根據(jù)美國國立癌癥研究所《常見不良反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)》（NCI-CTCAE v4.0）進(jìn)行判定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。 計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)（正態(tài)分布時）或者Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)（非正態(tài)分布時），同一樣本治療前后比較采用配對t 檢驗(yàn)。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC 和CIK 培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，DC 及CIK 細(xì)胞表型符合DC 及CIK 的特征。CIK 細(xì)胞在第3 天后開始增殖，第5～6 天快速增長。 在回輸入患者體內(nèi)前，收獲CIK 細(xì)胞分析其表型及細(xì)胞毒性。CIK 細(xì)胞效靶比為5∶1 時，CIK 細(xì)胞對MCF-7 的細(xì)胞毒活性為50.6%， 而正常外周單核細(xì)胞的細(xì)胞毒性僅為9.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.2 免疫治療前后患者外周血免疫學(xué)指標(biāo)變化

24 例患者中，19 例患者行1 個周期細(xì)胞治療，4 例患者行2 個周期細(xì)胞治療，1 例患者行3 個周期細(xì)胞治療。索拉非尼聯(lián)合自體DC-CIK 細(xì)胞治療后與治療前比較，患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測示，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯上升，而CD8+T 淋巴細(xì)胞比例、CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。 見表1。

表1 患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化（%，s）

表1 患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化（%，s）

時間 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD4+CD25+治療前治療后P 值55.97±11.71 67.80±8.50 0.018 30.18±8.33 40.40±7.71 0.021 25.41±6.22 17.34±4.52 0.005 1.08±0.60 1.89±0.53 0.011 7.12±1.71 4.57±1.56 0.034

2.3 臨床療效觀察

所有患者隨訪10～40 個月。24 例患者中CR 2 例（8.3%），PR 4 例（16.7%），SD 15 例（62.5%），PD 3 例（12.5%）；RR 為25.0%，DCR 為87.5%。隨訪截止日期為2015 年4 月，其中6 例死亡，18 例存活。

2.4 生活質(zhì)量

部分患者經(jīng)DC、CIK 細(xì)胞免疫治療后自覺生活質(zhì)量有所提升，具體表現(xiàn)為食欲增強(qiáng)、睡眠改善、疼痛減輕、體力較前好轉(zhuǎn)、索拉非尼治療的不良反應(yīng)減輕。所有患者治療前平均KPS 評分為（56.5±7.0）分，治療后平均KPS 評分為（75.7±7.3）分，治療前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。治療后生活質(zhì)量改善14 例（58.3%），穩(wěn)定6 例（25.0%），降低4 例（16.7%）。

2.5 不良反應(yīng)

DC-CIK 細(xì)胞免疫治療后，不良反應(yīng)一般出現(xiàn)在回輸后1～2 h。 其中發(fā)熱12 例，持續(xù)時間2～8 h，自行緩解7 例，5 例給予藥物對癥處理后緩解；皮疹16 例，均為1～2 級；血壓升高10 例；Ⅰ度轉(zhuǎn)氨酶升高1 例；Ⅱ度腹瀉2 例。 所有不良反應(yīng)均未達(dá)3～4 級。

3 討論

腎癌是起源于腎實(shí)質(zhì)中泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病。 目前為止， 根治性腎癌手術(shù)仍為治療腎癌的主要方法，但并非所有腎癌患者均可手術(shù)根治。 統(tǒng)計表明，患者中確診時發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的約占25%，術(shù)后患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者占30%，且大多數(shù)轉(zhuǎn)移性腎癌對放化療不敏感，預(yù)后較差。 細(xì)胞免疫治療及分子靶向藥物對腫瘤的生物治療取得了良好效果，并逐漸成為腎癌治療的重要手段之一[9-10]。

索拉菲尼是由德國Bayer 公司研發(fā)的靶向抗腫瘤藥物，于2005 年獲美國FDA 批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌。 索拉菲尼是首個口服多激酶抑制劑，靶向作用于腫瘤細(xì)胞以及腫瘤血管內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶受體和酪氨酸激酶受體，具有雙重抗腫瘤作用，既能通過抑制Raf/MEK/ERK 信號傳導(dǎo)通道直接抑制腫瘤生長，又能通過抑制與新生血管生成和腫瘤生長有關(guān)的酪氨酸激酶受體的活性， 阻斷腫瘤新生血管的生成，間接抑制腫瘤細(xì)胞生長[11-12]。 在多個臨床及臨床前試驗(yàn)中均顯示，索拉菲尼對晚期腎癌具有良好的治療效果，是晚期腎癌治療的重大進(jìn)展[13-15]。但是索拉非尼單一治療腎癌僅短期內(nèi)獲得較好的治療效果，長期生存時間并未獲得明顯改善。 因此，索拉非尼需要與其他的治療方法聯(lián)合，以期提高晚期腎癌的療效。

細(xì)胞免疫治療是一種新型的腫瘤治療手段，DC及CIK 是其中重要的兩種細(xì)胞。 DC 通過識別、攝取、提呈腫瘤抗原，可激活特異性抗腫瘤免疫[16]。CIK 是人工培育的一種異質(zhì)性的免疫細(xì)胞， 既具有T 細(xì)胞特性，也具有NK 細(xì)胞特性，具有廣譜抗腫瘤作用[17-18]。本研究對24 例晚期腎癌患者給予自體DC-CIK 細(xì)胞聯(lián)合索拉非尼治療的效果進(jìn)行了探討。 結(jié)果顯示24例患者中CR 2 例（8.3%），PR 4 例（16.7%），SD 15 例（62.5%），PD 3 例（12.5%）；RR 為25.0%，DCR 為87.5%。這證明索拉菲尼聯(lián)合細(xì)胞免疫治療能使患者獲得一定的臨床獲益。

腫瘤最終得以發(fā)展，一方面說明機(jī)體的免疫功能出現(xiàn)了缺陷， 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不足以對抗腫瘤細(xì)胞；另一方面也與腫瘤細(xì)胞自身的各種免疫逃逸有關(guān)。研究顯示，機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞的比例與機(jī)體免疫功能息息相關(guān)， 其中淋巴細(xì)胞亞群中CD3+總T 細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值與腫瘤患者的抗腫瘤免疫功能相關(guān)，CD3+T 細(xì)胞比例、CD4+T 細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值與腫瘤的病變程度呈負(fù)相關(guān)。同時，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞是免疫負(fù)性細(xì)胞，具有抑制抗腫瘤免疫的功能[19-21]。本研究結(jié)果顯示， 經(jīng)細(xì)胞治療聯(lián)合索拉菲尼治療后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯上升， 而CD8+T 淋巴細(xì)胞比例、CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例下降明顯，證明聯(lián)合治療能加強(qiáng)患者抗腫瘤免疫功能。

DC-CIK 治療的安全性較高，與其相關(guān)的不良反應(yīng)一般出現(xiàn)在回輸1～2 h。其中發(fā)熱12 例，皮疹16 例，血壓升高10 例，所有不良反應(yīng)均未達(dá)3～4 級，提示細(xì)胞免疫治療的安全性有所保障。

綜上所述，自體DC-CIK 細(xì)胞聯(lián)合索拉非尼治療晚期腎癌，能夠使患者獲得一定的臨床獲益，改善患者免疫功能，并有效改善患者的生活質(zhì)量，且發(fā)生的不良反應(yīng)大都在可耐受范圍， 具有臨床使用價值，值得進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究證實(shí)。

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