貢東軍　蘇耀輝　邸敬會(huì)　等

摘要：研究了地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的HPLC特征圖譜，并對(duì)其建立了近紅外光譜鑒別模型，確定了穩(wěn)定、可靠的地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的鑒別方法。

關(guān)鍵詞：撫順哈什螞油；高效液相色譜法；近紅外光譜

中圖分類(lèi)號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）22-5548-04

林蛙油又名哈什螞油、田雞油、蛤蟆油，為蛙科動(dòng)物林蛙（Rana temporaria）雌性成體的輸卵管干燥后形成的脂肪狀物質(zhì)。林蛙油能夠增加機(jī)體的免疫能力，具有健脾胃、滋陰補(bǔ)腎、潤(rùn)肺生津之功效，對(duì)體虛氣虛、神經(jīng)性頭痛、神經(jīng)衰弱均有效，且有鎮(zhèn)咳平喘的作用[1-4]。目前，學(xué)者對(duì)林蛙油的研究主要集中在對(duì)其成分的檢測(cè)方面[5-11]。本研究選用不同產(chǎn)地的18種林蛙油，建立了撫順哈什螞油近紅外光譜模型，實(shí)現(xiàn)地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的快速、準(zhǔn)確、無(wú)損的真?zhèn)舞b別。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 本研究所用樣品見(jiàn)表1。

1.1.2 儀器 美國(guó)Agilent 1100型高效液相色譜儀（配備G1310A單元泵、G1312A二元泵、G1311A四元泵、G1313A標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315A/B DAD檢測(cè)器），Agilent Instrument色譜工作站；NEX UP 1000型超純水凈化系統(tǒng)；金葉RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（配備津騰GM-0.33Ⅱ隔膜真空泵）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（配備金葉B-260恒溫水浴鍋）；AR1140型電子天平；德國(guó)布魯克光學(xué)儀器公司（Bruker Optics Inc.）MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，OPUS 6.5光譜采集及分析軟件。

1.1.3 試劑 甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Universil C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（最優(yōu)梯度）；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL[8]。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備 精確稱(chēng)取經(jīng)24 h真空干燥的林蛙油干燥粉末1.000 g，用濾紙包好，放入索氏提取器中。加入適量丙酮，用恒溫水浴鍋加熱6 h，保持溫度為70 ℃。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸干，色譜純甲醇溶解并定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品備用，制備了18個(gè)來(lái)自不同地域的樣品的供試品溶液。

1.3.2 試驗(yàn)方法 通過(guò)對(duì)不同地域蛙油的處理，提取蛙油中的有機(jī)部分，以乙腈-水為流動(dòng)相。本試驗(yàn)同時(shí)測(cè)定300、280和276 nm 3種波長(zhǎng)。峰總面積、峰總高度以及峰總數(shù)在檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm處均達(dá)到了最大值。因此，本試驗(yàn)選擇276 nm作為林蛙油的HPLC圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)，進(jìn)而研究和確定撫順哈什螞油的特征峰。以“1.2”的色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，得到18個(gè)樣品的指紋圖譜。計(jì)算樣品中各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間，并記錄各吸收峰的積分面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC圖譜結(jié)果

通過(guò)不同地域蛙油與撫順哈什螞油高效液相色譜圖的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)蛙油共有的較大的吸收峰出現(xiàn)在相對(duì)保留時(shí)間為0.491、0.523、0.694、0.834、0.904、1.000 min等處（表2、表3）。撫順哈什螞油在相對(duì)保留時(shí)間0.491 min處峰面積偏低，且分布不均勻，范圍在10.6～459.0 mAU·min之間；在相對(duì)保留時(shí)間0.523 min處，撫順哈什螞油吸收峰積分面積平均為320.96 mAU·min，水平居中，分布均勻，此處最高值為吉林延邊蛙油，而黑龍江長(zhǎng)白山特級(jí)林蛙油此處無(wú)吸收峰，可能由于在處理過(guò)程中造成一定的損失；在保留時(shí)間0.694 min處，各地與蛙油相差不大，內(nèi)蒙蛙油此處吸收峰面積較??；清原南口前鎮(zhèn)蛙油樣品在相對(duì)保留時(shí)間0.834 min處有一最大吸收峰，但撫順其他蛙油樣此處吸收峰面積均偏低；在相對(duì)保留時(shí)間0.904 min處，最大吸收峰仍是來(lái)自南口前鎮(zhèn)的樣品，撫順哈什螞油總體水平偏低，吉林蛙油此處吸收峰面積總體水平較高，平均為766.07 mAU·min。在標(biāo)準(zhǔn)吸收峰處，撫順哈什螞油吸收峰總體水平最低，最小吸收峰面積與最高值相差20多倍。北朝蛙油上述幾處吸收峰面積普遍較大。

撫順哈什螞油在相對(duì)保留時(shí)間為0.870和2.828 min處80%的樣品沒(méi)有吸收峰，而其他地域樣品絕大多數(shù)在此處有吸收峰；在相對(duì)保留時(shí)間0.349 min處吉林蛙油沒(méi)有吸收峰，相對(duì)保留時(shí)間0.349、2.771、3.010 min處撫順哈什螞油大多有吸收峰，而其他地域蛙油在此處大多沒(méi)有吸收峰。

2.2 不同地域蛙油近紅外光譜分析研究

通過(guò)使用近紅外掃描儀對(duì)不同地域林蛙油進(jìn)行掃描，建立了近紅外光譜鑒別模型來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)撫順哈什螞油特征因子的鑒別。不同地域蛙油近紅外光譜圖如圖1所示。由圖1可知，撫順哈什螞油與其他地域蛙油的近紅外光譜總體形狀相差不大，因此不能從光譜圖上直接分析不同產(chǎn)地蛙油的差別，借助化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件來(lái)對(duì)其進(jìn)行處理，采用OPUS化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件對(duì)光譜圖進(jìn)行處理。通過(guò)對(duì)光譜全波段進(jìn)行研究和分析，發(fā)現(xiàn)在7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1 3個(gè)波段范圍信息量較豐富，因此選取此光譜區(qū)域進(jìn)行后續(xù)處理。

2.2.1 合格性測(cè)試 以撫順哈什螞油近紅外譜作為參考光譜，其他產(chǎn)地蛙油近紅外光譜作為測(cè)試光譜，預(yù)處理選擇一階導(dǎo)數(shù)法，光譜波段選擇7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1，平滑點(diǎn)數(shù)17，可得參考光譜和測(cè)試光譜的最大合格性索引如圖2所示。圖2顯示參考光譜的索引值穩(wěn)定分布在1.2～2.6之間，表明撫順哈什螞油質(zhì)量較穩(wěn)定，而測(cè)試光譜的索引值分布在2.7～7.7之間，樣品之間的值較分散且波動(dòng)較大。合格性測(cè)試報(bào)告顯示在特定條件下此模型可以將撫順哈什螞油和其他產(chǎn)地蛙油分開(kāi)，準(zhǔn)確率為100%。endprint

2.2.2 主成分分析 主成分分析是將原變量進(jìn)行變換，用數(shù)目較少的新變量代替原變量，且新變量能最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)去除無(wú)用信息。將撫順哈什螞油和其他產(chǎn)地蛙油近紅外譜圖采用減直線(xiàn)法，因子數(shù)為5，光譜范圍為：7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1，進(jìn)行主成分分析，并以第一主成分PC1為X軸，第二主成分PC2為Y軸，作主成分（PCA）得分圖如圖3所示。由圖3中可看出，撫順哈什螞油的樣品在主成分特征空間上的分布較為集中，撫順哈什螞油為聚集在圖中標(biāo)識(shí)的橢圓型區(qū)域內(nèi)淺色方塊，而其余深色三角為其他產(chǎn)地蛙油樣品，在主成分特征空間上的分布大部分在真品區(qū)之外，表明其與真品質(zhì)量具有一定的差異。

結(jié)果表明，分別引入合格性測(cè)試法和主成分分析法兩種模式識(shí)別方法，能夠很好地辨別撫順哈什螞油的真?zhèn)?。采用合格性測(cè)試方法可以鑒別真?zhèn)螕犴樄参浻?，?zhǔn)確率為100%；而采用主成分分析法也可以較好地完成真?zhèn)舞b別，鑒別率為90.04%。研究結(jié)果表明，撫順哈什螞油采用近紅外光譜和模式識(shí)別技術(shù)結(jié)合可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行真?zhèn)舞b別。

3 小結(jié)

通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行特定處理，可利用高效液相色譜特定吸收對(duì)撫順哈什螞油的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，而利用近紅外光譜和模式識(shí)別技術(shù)結(jié)合，則可實(shí)現(xiàn)地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的快速、準(zhǔn)確、無(wú)損的真?zhèn)舞b別。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1997.

[2] 全國(guó)中草藥匯編組.全國(guó)中草藥匯編[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978.

[3] 毛煥新，尤秀新，程光惠，等.林蛙油軟膠囊抗疲勞作用的試驗(yàn)研究[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，31（6）：40-41.

[4] 李月紅，黃 權(quán)，周景祥，等.林蛙油對(duì)衰老模型小鼠部分生理指標(biāo)的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26（6）：646-648.

[5] 王春霖，王麗蘭，姜言功，等.哈士蟆油甾體性激素定量分析及藥理作用[J].中國(guó)中藥雜志，1985（2）：21-23.

[6] 胡 鑫，劉成柏，陳曉平，等.林蛙油中主要營(yíng)養(yǎng)保健成分含量的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（2）：218-220.

[7] 崔貞玉，王 琳，張 琨，等.林蛙油對(duì)老年雌性大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2002（3）：204.

[8] 李妍妍，鄭衛(wèi)星，王日昕，等.林蛙營(yíng)養(yǎng)成分的多元分析[J].食品科學(xué)，2007，28（12）：472-475.

[9] 李津明，許 婷，賈紹華.林蛙油的指紋圖譜[J].中草藥，2005，36（4）：591-595.

[10] 劉曉曄，湯曉艷，孫寶忠，等.普通公牛肉和淘汰母牛肉的近紅外光譜鑒別方法[J].食品科學(xué)，2012，33（24）：244-248.

[11] 張 寧，張德權(quán)，李淑榮，等.近紅外光譜結(jié)合SIMCA法溯源羊肉產(chǎn)地的初步研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（12）：309-312.

（責(zé)任編輯 屠 晶）endprint

2.2.2 主成分分析 主成分分析是將原變量進(jìn)行變換，用數(shù)目較少的新變量代替原變量，且新變量能最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)去除無(wú)用信息。將撫順哈什螞油和其他產(chǎn)地蛙油近紅外譜圖采用減直線(xiàn)法，因子數(shù)為5，光譜范圍為：7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1，進(jìn)行主成分分析，并以第一主成分PC1為X軸，第二主成分PC2為Y軸，作主成分（PCA）得分圖如圖3所示。由圖3中可看出，撫順哈什螞油的樣品在主成分特征空間上的分布較為集中，撫順哈什螞油為聚集在圖中標(biāo)識(shí)的橢圓型區(qū)域內(nèi)淺色方塊，而其余深色三角為其他產(chǎn)地蛙油樣品，在主成分特征空間上的分布大部分在真品區(qū)之外，表明其與真品質(zhì)量具有一定的差異。

結(jié)果表明，分別引入合格性測(cè)試法和主成分分析法兩種模式識(shí)別方法，能夠很好地辨別撫順哈什螞油的真?zhèn)?。采用合格性測(cè)試方法可以鑒別真?zhèn)螕犴樄参浻停瑴?zhǔn)確率為100%；而采用主成分分析法也可以較好地完成真?zhèn)舞b別，鑒別率為90.04%。研究結(jié)果表明，撫順哈什螞油采用近紅外光譜和模式識(shí)別技術(shù)結(jié)合可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行真?zhèn)舞b別。

3 小結(jié)

通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行特定處理，可利用高效液相色譜特定吸收對(duì)撫順哈什螞油的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，而利用近紅外光譜和模式識(shí)別技術(shù)結(jié)合，則可實(shí)現(xiàn)地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的快速、準(zhǔn)確、無(wú)損的真?zhèn)舞b別。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1997.

[2] 全國(guó)中草藥匯編組.全國(guó)中草藥匯編[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978.

[3] 毛煥新，尤秀新，程光惠，等.林蛙油軟膠囊抗疲勞作用的試驗(yàn)研究[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，31（6）：40-41.

[4] 李月紅，黃 權(quán)，周景祥，等.林蛙油對(duì)衰老模型小鼠部分生理指標(biāo)的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26（6）：646-648.

[5] 王春霖，王麗蘭，姜言功，等.哈士蟆油甾體性激素定量分析及藥理作用[J].中國(guó)中藥雜志，1985（2）：21-23.

[6] 胡 鑫，劉成柏，陳曉平，等.林蛙油中主要營(yíng)養(yǎng)保健成分含量的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（2）：218-220.

[7] 崔貞玉，王 琳，張 琨，等.林蛙油對(duì)老年雌性大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2002（3）：204.

[8] 李妍妍，鄭衛(wèi)星，王日昕，等.林蛙營(yíng)養(yǎng)成分的多元分析[J].食品科學(xué)，2007，28（12）：472-475.

[9] 李津明，許 婷，賈紹華.林蛙油的指紋圖譜[J].中草藥，2005，36（4）：591-595.

[10] 劉曉曄，湯曉艷，孫寶忠，等.普通公牛肉和淘汰母牛肉的近紅外光譜鑒別方法[J].食品科學(xué)，2012，33（24）：244-248.

[11] 張 寧，張德權(quán)，李淑榮，等.近紅外光譜結(jié)合SIMCA法溯源羊肉產(chǎn)地的初步研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（12）：309-312.

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2.2.2 主成分分析 主成分分析是將原變量進(jìn)行變換，用數(shù)目較少的新變量代替原變量，且新變量能最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)去除無(wú)用信息。將撫順哈什螞油和其他產(chǎn)地蛙油近紅外譜圖采用減直線(xiàn)法，因子數(shù)為5，光譜范圍為：7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1，進(jìn)行主成分分析，并以第一主成分PC1為X軸，第二主成分PC2為Y軸，作主成分（PCA）得分圖如圖3所示。由圖3中可看出，撫順哈什螞油的樣品在主成分特征空間上的分布較為集中，撫順哈什螞油為聚集在圖中標(biāo)識(shí)的橢圓型區(qū)域內(nèi)淺色方塊，而其余深色三角為其他產(chǎn)地蛙油樣品，在主成分特征空間上的分布大部分在真品區(qū)之外，表明其與真品質(zhì)量具有一定的差異。

結(jié)果表明，分別引入合格性測(cè)試法和主成分分析法兩種模式識(shí)別方法，能夠很好地辨別撫順哈什螞油的真?zhèn)?。采用合格性測(cè)試方法可以鑒別真?zhèn)螕犴樄参浻?，?zhǔn)確率為100%；而采用主成分分析法也可以較好地完成真?zhèn)舞b別，鑒別率為90.04%。研究結(jié)果表明，撫順哈什螞油采用近紅外光譜和模式識(shí)別技術(shù)結(jié)合可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行真?zhèn)舞b別。

3 小結(jié)

通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行特定處理，可利用高效液相色譜特定吸收對(duì)撫順哈什螞油的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，而利用近紅外光譜和模式識(shí)別技術(shù)結(jié)合，則可實(shí)現(xiàn)地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的快速、準(zhǔn)確、無(wú)損的真?zhèn)舞b別。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1997.

[2] 全國(guó)中草藥匯編組.全國(guó)中草藥匯編[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978.

[3] 毛煥新，尤秀新，程光惠，等.林蛙油軟膠囊抗疲勞作用的試驗(yàn)研究[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，31（6）：40-41.

[4] 李月紅，黃 權(quán)，周景祥，等.林蛙油對(duì)衰老模型小鼠部分生理指標(biāo)的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26（6）：646-648.

[5] 王春霖，王麗蘭，姜言功，等.哈士蟆油甾體性激素定量分析及藥理作用[J].中國(guó)中藥雜志，1985（2）：21-23.

[6] 胡 鑫，劉成柏，陳曉平，等.林蛙油中主要營(yíng)養(yǎng)保健成分含量的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（2）：218-220.

[7] 崔貞玉，王 琳，張 琨，等.林蛙油對(duì)老年雌性大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2002（3）：204.

[8] 李妍妍，鄭衛(wèi)星，王日昕，等.林蛙營(yíng)養(yǎng)成分的多元分析[J].食品科學(xué)，2007，28（12）：472-475.

[9] 李津明，許 婷，賈紹華.林蛙油的指紋圖譜[J].中草藥，2005，36（4）：591-595.

[10] 劉曉曄，湯曉艷，孫寶忠，等.普通公牛肉和淘汰母牛肉的近紅外光譜鑒別方法[J].食品科學(xué)，2012，33（24）：244-248.

[11] 張 寧，張德權(quán)，李淑榮，等.近紅外光譜結(jié)合SIMCA法溯源羊肉產(chǎn)地的初步研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（12）：309-312.

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