吳程雨, 葉 飄, 楊孝婷, 徐葉倩, 鞏孝磊, 唐琦清, 趙輔昆, 潘建義, 陳 瑋

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310018)

固定化地衣芽孢桿菌胞外脂肪酶的制備

吳程雨, 葉 飄, 楊孝婷, 徐葉倩, 鞏孝磊, 唐琦清, 趙輔昆, 潘建義, 陳 瑋

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310018)

脂肪酶是一類重要的水解酶,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。脂肪酶通過固定化可以提高酶的使用效率。文章采用戊二醛共價連接法將來源于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的胞外脂肪酶固定于氨基型載體ZH-HA之上,將1 g載體置入10 mL酶液中反應(yīng)3 h后固定化酶活力達(dá)到最高為60 U/g濕載體。經(jīng)固定化后該酶的溫度穩(wěn)定性得到顯著提升,當(dāng)反應(yīng)溫度為45℃時最高酶活力達(dá)到220 U/g濕載體。同時,固定化使酶在堿性條件下的穩(wěn)定性得到提高,最適反應(yīng)pH值為10。通過自制柱式反應(yīng)器考察該酶工作穩(wěn)定性,經(jīng)過15批連續(xù)水解反應(yīng),固定化脂肪酶仍保持90%的活力,展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

地衣芽孢桿菌; 脂肪酶; 固定化; ZH-HA

0 引 言

脂肪酶(三?；视王ニ饷?EC 3.1.1.3)[1],屬于水解酶類家族,除了水解作用,脂肪酶還能催化其它多種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng),如有機(jī)合成反應(yīng)、酸解、氨解、酯化反應(yīng)、酯交換反應(yīng)及酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)等[2-3]。脂肪酶在自然界中廣泛存在[4],不僅有參與新陳代謝的重要生理作用,而且有很大的工業(yè)價值,包括一些特殊有機(jī)物的合成,脂肪和油類的水解,食品工業(yè)發(fā)展中香料的改進(jìn)以及化學(xué)分析等[5]。此外,脂肪酶還可以催化動、植物油脂發(fā)生酯交換反應(yīng)得到脂肪酸甲酯或乙酯類物質(zhì),該類物質(zhì)是生物柴油的重要組成部分,它不含芳香烴,對環(huán)境友好,與普通燃油相比,極大降低污染物的排放[6-8],且生物柴油屬于可再生能源,并且還具有潤滑性能良好、燃燒充分、便于運輸及使用安全等性能[9-10]。同時,酶法合成生物柴油,還能進(jìn)一步合成其他一些高附加值的產(chǎn)品。因此,脂肪酶在工業(yè)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力。

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)脂肪酶屬于α/β水解酶超家族[11],該酶為胞外脂肪酶,分子量約為20 kD,易于通過細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn),在堿性的條件下(pH>9.5)催化活力較高,具有一定的工業(yè)應(yīng)用價值,但是該酶也存在熱穩(wěn)定性較低的缺點,制約其生產(chǎn)應(yīng)用。

固定化是脂肪酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的重要途徑[12],固定化技術(shù)可提高酶的穩(wěn)定性,并能實現(xiàn)酶的長期反復(fù)使用,從而降低生產(chǎn)成本。此外,固定化載體的基團(tuán)會影響反應(yīng)體系的微環(huán)境,從而改變游離酶的一些特性。有多種方法可以進(jìn)行酶的固定化,其中吸附法是最常見的方法之一,該法具有操作簡單,條件溫柔,活力回收率高等特點,然而吸附法往往因酶與載體的結(jié)合力較弱從而使得酶容易脫落。共價法固定化是另一種常見的方法,可通過共價鍵將酶牢固地連接在載體之上。在脂肪酶固定化的研究中,溴化氰活化多糖載體法、疊氮基團(tuán)法、環(huán)氧基團(tuán)法等已被使用,然而這些方法都含有劇毒物質(zhì)或者反應(yīng)時間過長的等缺點。ZH-HA是一種氨基型載體,可以快速和醛基形成席夫堿(Schiff base)使得酶分子表面氨基酸殘基與載體形成牢固的共價連接,該法具有操作簡單,條件溫和等特點。在本研究中,筆者應(yīng)用ZH-HA作為載體,將來源于地衣芽孢桿菌的脂肪酶固定化,同時也分析對比固定化酶與游離脂肪酶的基本性質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)脂肪酶產(chǎn)自基因工程重組的枯草芽孢桿菌,由本實驗發(fā)酵制備。對硝基苯棕櫚酸酯(pNPP),脫氧膽酸鈉,阿拉伯樹膠均購自Sigma Aldrich公司。載體ZH-HA由香港GeneRad Biotech Laboratory Ltd提供。ZH-HA[13]是以甲基丙烯酸縮水甘油酯(Glycidyl methacrylate)為單體的高分子多孔聚合物,表面由環(huán)氧基團(tuán)活化后再經(jīng)過聚乙烯亞胺處理制得的氨基型載體,基團(tuán)密度105 mM/g濕載體(含水量55%～60%)。顆粒直徑150～300 μm。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 酶的固定化

取1 g載體,用濃度為0.1 mol/L,pH值為8的磷酸緩沖液洗滌3次后加入10 mL濃度為2%的戊二醛活化1 h,之后用相同緩沖液充分洗滌載體。經(jīng)活化后的載體按1 g對應(yīng)10 mL的比例加入酶液,該酶液由重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵所得,酶活力為50 U/mL,混勻并置于搖床上,反應(yīng)一定時間后棄去上清液,沉淀為固定化酶顆粒,用PBS充分洗滌。

1.3 酶活力測定

A液:異丙醇溶液(含有濃度為16.5 mmol/L的對硝基苯棕櫚酸酯(pNPP)),B 液:濃度為50 mmol/L,pH值為8.5的PBS溶液(含有0.2%的脫氧膽酸鈉及0.1%的阿拉伯樹膠)。在測定時,將A液與B液按1∶9混合后取900 μL作為底物加入100 μL適當(dāng)稀釋的酶液,37℃ 反應(yīng)10 min后,快速加入1 mL 95%乙醇終止反應(yīng),再用可見分光光度計讀取410 nm處的吸光度值。在此反應(yīng)條件下,對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)為14 600 L/mol·cm-1。脂肪酶活力單位(U)定義為單位時間內(nèi)(1 min)水解pNPP并釋放出1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

固定化酶的活力測定方法與游離酶類似,稱取一定量的固定化酶顆粒,加入5 mL經(jīng)過預(yù)熱底物溶液,并用小型臺式電動機(jī)以300 r/min的轉(zhuǎn)速經(jīng)行攪拌,反應(yīng)4 min后,加入5 mL無水乙醇中止反應(yīng),吸取反應(yīng)上清液測定A410吸光值。

1.4 工作穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取20 mg固定化酶顆粒裝入帶有保溫夾套的柱式反應(yīng)器中,加入20 mL,45℃預(yù)熱的底物溶液,攪拌反應(yīng)10 min,加入20 mL乙醇終止后,取出反應(yīng)液測定A410吸光值。用相同緩沖溶液將反應(yīng)器中的固定化酶顆粒反復(fù)洗滌幾次,然后重復(fù)上述操作,繼續(xù)進(jìn)行下一批反應(yīng)。

2 結(jié)果和討論

2.1 脂肪酶的固定化

ZH-HA是一種多孔型高分子聚合物,表面帶有氨基基團(tuán),固定化之前先采用過量的戊二醛對其進(jìn)行活化,即用戊二醛的一端醛基與其氨基形成席夫堿(Schiff base)連接?；罨筝d體所帶有的醛基又可以和酶分子表面氨基酸殘基的氨基形成席夫堿鏈接,從而將酶固定在載體表面及孔道內(nèi)部。這個過程中酶在載體表面及孔道內(nèi)部需經(jīng)歷一個擴(kuò)散、吸附進(jìn)而與載體活性基團(tuán)間發(fā)生共價連接的過程[14-17],因此需要確定最佳的固定化反應(yīng)時間。

固定化酶反應(yīng)時間如圖1示,隨著時間的積累,酶與載體結(jié)合,固定化酶活力呈現(xiàn)上升趨勢,在3 h處達(dá)到頂峰為60 U/g濕載體,而繼續(xù)延長時間固定化酶活力呈緩慢下降趨勢。這是由于過長時間反應(yīng)使得酶的多個基團(tuán)與固定化載體間形成多組共價連接,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子被過度束縛,影響了固定化酶活力。因此,從實驗結(jié)果可以判斷,當(dāng)反應(yīng)發(fā)生3 h之后,脂肪酶的和載體形成的連接處于一種最優(yōu)狀態(tài),即可最大限度的負(fù)載分子蛋白,又避免過度的連接而導(dǎo)致酶活力的下降,在后期選擇該時間點為固定化反應(yīng)時間,并且在固定化反應(yīng)結(jié)束后向體系中添加入牛血清白蛋白至終濃度為0.1 mg/mL,以封閉未與酶連接的醛基,從而使固定化酶處于最佳狀態(tài)。

2.2 游離酶與固定化酶最適反應(yīng)pH值對比

pH值對酶的活性有顯著影響,酶分子活性部位往往是由空間上相鄰的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)處于特定的解離狀態(tài)而形成相互作用,隨著pH值的變化,會引起基團(tuán)解離狀態(tài)的改變,從而破壞酶活性部位的結(jié)構(gòu),因此酶通常只在一定pH值范圍內(nèi)表現(xiàn)出最佳活性。

本實驗采用不同pH值緩沖溶液配置底物考察游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)pH值,各組以特定pH值條件下測得的最高活力為100%,結(jié)果如圖2所示(反應(yīng)溫度均為37℃)。游離酶在pH值為9時表現(xiàn)出最高酶活力,而固定化酶最適反應(yīng)pH值則偏向于堿性區(qū)域,即在pH值為10時表現(xiàn)出最高酶活力(如圖2)。引起這種現(xiàn)象的原因是ZH-HA載體表面的一些帶負(fù)電的基團(tuán)更傾向于吸引并聚集帶正電核的氫離子,使酶反應(yīng)區(qū)域微環(huán)境的pH值呈下降趨勢,為了抵銷這一影響,溶液的pH值必須向堿性方向偏移,才能使酶活力達(dá)到最大。所以固定化酶的最適pH值曲線向堿性方向偏移[18]。由此可見,酶在固定化的過程中,部分表面基團(tuán)和載體形成新的共價鍵,同時載體表面的部分游離基團(tuán)也會影響反應(yīng)體系的微環(huán)境,從而改變酶的一些特性。因此,通過固定化技術(shù)可以實現(xiàn)酶的一些基本特性得到可控的改變,從而使酶具有更廣泛的應(yīng)用性。

2.3 溫度對固定化的影響

溫度敏感性是酶的又一重要特性,提升溫度一方面能夠加快酶反應(yīng)的速度,另一方面也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性而失活。任一酶促反應(yīng)都是在一定溫度條件下進(jìn)行的,溫度的這兩種效應(yīng)都會發(fā)生作用。因此,“最適溫度”是這兩種效應(yīng)的綜合結(jié)果。本實驗控制不同溫度進(jìn)行催化反應(yīng),考察游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)溫度,分別在30、35、40、45、50℃條件下測定酶活力,定義實驗所獲得的最高酶活力為100%,結(jié)果如圖3所示(反應(yīng)pH值均為10)。圖3可見，游離酶在35℃時表現(xiàn)出最大活力,隨著溫度的升高則由于熱變性使其活力明顯降低,固定化酶最適溫度在45℃,實際活力達(dá)到220 U/g。相較游離酶而言,固定化酶的熱穩(wěn)定性得到了明顯的提高,這說明通過固定化形成的共價鍵有助于增強酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性從而抵御熱變性,因此顯著提高了使得固定化酶的催化活力。在工業(yè)生產(chǎn)中,提供較高的反應(yīng)溫度,一方面有利于增加脂類物質(zhì)的溶解性,降低反應(yīng)介質(zhì)粘度,減少傳質(zhì)阻力;另一方面,較高的溫度可防止連續(xù)長時間反應(yīng)過程中產(chǎn)生雜菌污染,更有利于工業(yè)上持續(xù)生產(chǎn),因此該固定化酶具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

2.4 工作穩(wěn)定性

固定化酶最重要的特點是實現(xiàn)酶的反復(fù)利用,本實驗中利用了共價法固定化制備的固定化酶可以使酶與載體牢固地結(jié)合,酶的工作穩(wěn)定性采用自制柱式反應(yīng)器測定(如圖4)。取20 mg固定化酶裝入夾套保溫的柱式反應(yīng)器中,加入20 mL,45℃預(yù)熱的底物溶液,攪拌反應(yīng)10 min,加入20 mL乙醇滅活后,取出反應(yīng)液測定A410吸光值。用相同緩沖溶液將反應(yīng)器中的固定化酶顆粒反復(fù)洗滌幾次,然后重復(fù)上述操作,繼續(xù)進(jìn)行下一批反應(yīng)。初始批次酶活力定義為100%,重復(fù)反應(yīng)15次,結(jié)果如圖5示。圖5顯示，固定化酶在反復(fù)使用15批次之后酶活力

仍保持在90%以上。固定化酶的特點是實現(xiàn)酶的反復(fù)利用,從而降低總的生產(chǎn)成本。因此,工作穩(wěn)定性是考察固定化酶實用性的重要指標(biāo)。同時,固定化酶的另一特點是可以通過篩網(wǎng)將酶與反應(yīng)體系完全分離,避免了酶作為可溶性蛋白質(zhì)而成為產(chǎn)物中的雜質(zhì)。相較于傳統(tǒng)的吸附法、包埋法而言,該酶通過醛基與其氨基形成席夫堿(Schiff base)使得酶分子表面氨基酸殘基與載體形成牢固的共價連接,使得該酶具有很好的穩(wěn)定性,由此可見,該固定化酶具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。

3 結(jié) 論

酶的固定化技術(shù)是其應(yīng)用于生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟之一,通過固定化可實現(xiàn)酶的反復(fù)利用,降低生產(chǎn)成本。在本工作中,地衣芽孢桿菌來源的胞外脂肪酶被固定化在經(jīng)戊二醛活化后的氨基型載體ZH-HA上。得到的固定化酶顆粒具有較高的熱穩(wěn)定性,并且具有很高的工作穩(wěn)定性,因此該固定化脂肪酶具有一定的工業(yè)應(yīng)用潛力。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Preparation of Immobilized Extracellular Lipase fromBacillusLicheniformis

WU Cheng-yu, YE Piao, YANG Xiao-ting, XU Ye-qian, GONG Xiao-lei, TANG Qi-qing,ZHAO Fu-kun, PAN Jian-yi, CHEN Wei

(School of Life Science, Zhejiang Science and Technology University, Hangzhou 310018, China)

Lipase is a kind of important hydrolase which is widely used in food, medicine, and chemical industry etc. Lipase immobilization can improve the usage efficiency of lipase. In this study, glutaraldehyde covalent linkage was applied to fix extracellular lipase fromBacilluslicheniformisto amino carrier ZH-HA. After 1 g carrier was put into 10 mL enzyme solution and reacted for 3h, the activity of immobilized lipase was up to 60 U/g wet carrier. The temperature stability of the immobilized enzyme was significantly improved, and the highest enzyme activity reached up to 220 U/g wet carriers at 45℃. Moreover, immobilization made enzyme stability boost under alkaline condition, and the optimal pH value for reaction was 10. Working stability of this enzyme was investigated through self-made column reactor. After continuous hydrolysis reaction for 15 batches, the immobilized lipase still remained 90% activity and it showed good operational stability.

Bacilluslicheniformis; lipase; immobilization; ZH-HA

1673- 3851 (2015) 05- 0694- 05

2014-11-21

國家自然科學(xué)基金項目(31200110);浙江省高校生物學(xué)重中之重(一級)學(xué)科開放基金項目(2012D11);浙江理工大學(xué)科研啟動基金項目(13042166-Y)

吳程雨(1990-),男,廣西桂林人,碩士研究生,主要從事分子生物學(xué)和微生物發(fā)酵方面的研究。

陳 瑋,E-mail:cw@zstu.edu.cn

Q786

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