孫連蓮，賀卯蘇，遲長鳳，周 林，劉慧慧，史會來

（1.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

頭足類動物（Cephalopods）是一種比較高等的海洋軟體動物，大多分布于太平洋、大西洋，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。頭足類動物的身體大多為圓柱形，有強健的可伸縮的腕，眼睛發(fā)育的很好，是最大的無脊椎動物。頭足類數(shù)量眾多，是可獲取最大的資源之一，常見物種有烏賊、蛸、魷魚等。頭足類動物種類豐富、有較高的食用價值與藥用價值，且其生長速度快、生命周期短，被譽為重要的蛋白質(zhì)資源。近年來隨著人們對頭足類的經(jīng)濟價值的重視，國內(nèi)外關(guān)于頭足類的研究日趨深入。耳石是頭足類重要的器官，具有接收聲音和平衡定向的作用，位于頭部平衡囊內(nèi)，左右兩側(cè)各有一個。耳石的生長是一個礦化過程，細(xì)胞吸收周圍環(huán)境中的各種化學(xué)元素，按照規(guī)律形成特定結(jié)構(gòu)，因此耳石內(nèi)部沉積著水環(huán)境中的化學(xué)元素[1]，是生活史的記錄儀器，被廣泛用于頭足類漁業(yè)生物學(xué)的研究。

頭足類耳石是一種鈣化組織，組成成份分為無機物和有機物兩種，無機物主要成分是碳酸鈣鹽結(jié)晶，含量占耳石整體的95%以上；有機物主要成分為蛋白質(zhì)，含量占耳石整體的4%～5%，蛋白質(zhì)又有可溶性和不可溶性兩種，其中不溶性蛋白會影響耳石生長紋的規(guī)律性沉積。頭足類耳石的生長貫穿整個生命歷程，且耳石的沉積過程具有不可逆性，只有在極度缺氧的情況下才會發(fā)生耳石的再吸收。耳石記錄了能推算生長特性的輪紋以及推斷生活環(huán)境的化學(xué)元素等，因此被廣泛應(yīng)用于研究頭足類的年齡與生長、種群劃分等領(lǐng)域。

1 耳石的提取與保存

耳石的提取參考前人方法[2]。取出的耳石，一般都存放于高濃度乙醇溶液中，高濃度乙醇溶液有助于清除耳石表面的有機物質(zhì)，最常用的是95%乙醇溶液。耳石也可保存在石蠟溶液中[3]或冷凍干燥保存[4]。不同用處的耳石在保存前需做不同的處理，如直接用于讀取日齡的耳石在保存前需清洗掉黏附在耳石表面的污漬，一般選用超聲波或者10%的NaOH溶液；而需要打磨后再用作日齡鑒定的耳石只需用蒸餾水略洗幾下，即可放入95%乙醇溶液中保存。在操作過程中值得注意的是，福爾馬林會使耳石變脆易碎且影響輪紋觀察效果，因此，不能用福爾馬林溶液保存耳石。

2 頭足類耳石的結(jié)構(gòu)特征

2.1 頭足類耳石形態(tài)結(jié)構(gòu)

頭足類耳石上有一個中心核，耳石的沉積就是從這里開始的。耳石原基位于核的中心，日輪依次向外呈環(huán)狀同心排列。盡管不同頭足類物種的耳石的形狀有所不同，但其日輪結(jié)構(gòu)基本相似。在光學(xué)顯微鏡下，日輪排列有序、明暗間隔，在掃描電子顯微鏡下，日輪則由透明的寬帶和暗色的窄帶間歇組成。

耳石一般包括吻區(qū)（R）、側(cè)區(qū)（LD）、背區(qū)（DD）和翼區(qū)（W）4個部分。在研究頭足類生長特性時，耳石總長（TSL）、吻區(qū)長（RL）、吻側(cè)區(qū)長（RLL）、翼區(qū)長（WL）、背側(cè)區(qū)長（DLL）等形態(tài)特征參數(shù)較為常用。對頭足類耳石外部形態(tài)參數(shù)進行測量時，選取一個耳石進行圖像拍照，測量之前要校準(zhǔn)。同一耳石，由兩個人各自獨立測量一次，測量結(jié)果精確至0.01 μm，當(dāng)兩次測量結(jié)果的誤差小于5%時，結(jié)果可用，取它們的平均值，否則需重新測量[2]。

耳石形態(tài)特征會受一些環(huán)境因素（溫度、鹽度、光周期）影響，個體差異和性別差異也會對耳石的形態(tài)特征產(chǎn)生一定影響，如ARKHIPKIN等[5]研究證明個體生長對耳石形態(tài)產(chǎn)生重要影響。

2.2 頭足類耳石輪紋

耳石輪紋多用于推算頭足類的年齡以及其生長特性。多數(shù)頭足類壽命不長，因此基本上都是用日輪。真蛸、烏賊等頭足類耳石的掃描電鏡照片在1976年首次出現(xiàn)，但當(dāng)時并無關(guān)于耳石輪紋結(jié)構(gòu)的報道。YOUNG[6]是第一個在研究錐槍烏賊Alloteuthis subulata和真蛸Octopus vulgaris時發(fā)現(xiàn)耳石具有輪紋結(jié)構(gòu)的。隨后又在卡氏柔魚Ommastrephes caroli和翼柄柔魚Ommastrephes pteropus兩物種中發(fā)現(xiàn)了耳石輪紋沉積的規(guī)律。SPRATT[7]首次對頭足類耳石生長迭片結(jié)構(gòu)以及年齡研究和分析方法進行了闡述。LIPINSKI[8]于1979年正式提出“一輪紋即是一天”的假說。目前，關(guān)于證實頭足類耳石輪紋日周期性的方法主要有三種：實驗室飼養(yǎng)法、化學(xué)標(biāo)記法和連續(xù)采樣法。實驗室飼養(yǎng)法已證實了萊氏擬烏賊Sepioteuthis lessoniana和三角鉤腕烏賊Abralia trigonura[9]的耳石輪紋具有日周期性的特征；化學(xué)標(biāo)記法使夜光槍烏賊Loliolus nocticula[10]、槍烏賊Loligo vulgaris[11]、好望角槍烏賊Loligo vulgaris reynaudi[12]的輪紋日周期性得到了證實；連續(xù)取樣法已應(yīng)用于滑柔魚Illex coindetill、阿根廷滑柔魚Illex argentines等的年齡研究，其結(jié)論基本支持一輪紋代表一天的假說[13]。

耳石輪紋結(jié)構(gòu)通常在光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡下進行計數(shù)分析，牟善彬等[14]對各種制備觀察耳石樣本的方法給出了具體描述。兩種觀察方法都需要制備磨片，耳石研磨參照陸化杰[15]的方法進行。不同大小、形態(tài)的耳石制備方法不同，但研磨平面通常都選擇縱截面研磨。在研究頭足類耳石時常觀察到亞日輪，如貝烏賊Berryteuthis magister[16]和鳶烏賊Symplectoteuthis oualaniensis[17]，因此在日輪鑒定過程中需注意亞日輪對年齡推算準(zhǔn)確性的影響。頭足類的生長依賴于溫度，溫度會影響耳石輪紋形成過程，大幅度的波動可能是影響亞日輪形成的主要因素。

2.3 頭足類耳石微化學(xué)組成

2.3.1 耳石微量元素

耳石微量元素的沉積具有不可逆轉(zhuǎn)性的特點，因此耳石可以永久地記錄個體生活史中各階段的環(huán)境狀況，根據(jù)微量元素含量及比值可模擬其生活史中的環(huán)境條件，重現(xiàn)生活環(huán)境，因此有關(guān)耳石微量元素的研究得到人們越來越多的關(guān)注。生物礦化過程的基本結(jié)果已經(jīng)報道這一點，但是元素被吸收到耳石的確切原理尚未闡明。鍶（Sr）和鎂（Mg）這兩種元素是關(guān)鍵因素，它們參與鈣化過程，并負(fù)責(zé)耳石的生長層，是耳石微量元素研究的主要對象。Mg元素含量高低與有機物成份含量多少有關(guān)，且Mg元素含量會隨著耳石增大而減小[18]。

不同孵化群體和不同性別的頭足類耳石中微量元素存在差異，如哥斯達黎加外海莖柔魚耳石中含有54種微量元素，智利外海莖柔魚耳石由48種微量元素組成，但其中的主要微量元素相同。耳石不同部位的微量元素種類和含量在也存在差異，通過對烏賊耳石的研究，發(fā)現(xiàn)不同部位的鈣Ca（鈣）、Sr、鋇（Ba）等元素都有明顯差異。耳石輪紋的清晰度與Sr元素含量有關(guān)。

2.3.2 耳石同位素

同位素的研究主要包括碳（C）、硫（S）和氧（O）三種元素。耳石中的氧（16O、18O）、碳（12C、13C、14C）元素能在一定程度上反應(yīng)出頭足類的年齡和生長率、生活區(qū)域的水溫狀況、棲息地水深程度等重要信息。UREY[19]和DEVEREUX[20]成功測定碳酸鈣中氧元素的含量，使得耳石同位素研究作為推測棲息環(huán)境溫度的依據(jù)。

RADTKE[21]利用同位素分析技術(shù)以及X射線衍射法對滑柔魚耳石中的C、O元素進行分析，發(fā)現(xiàn)滑柔魚生活環(huán)境中的O元素與其耳石中的沉積的O元素存在一種平衡關(guān)系，且根據(jù)耳石O同位素比值推算出的生活環(huán)境水溫與實際捕獲滑柔魚時測得的水溫十分相似，由此得出生活環(huán)境的水溫狀況跟耳石中O同位素的比值密切相關(guān)，同時推測C同位素跟滑柔魚的代謝等生理活動狀況密切相關(guān)。根據(jù)桑氏大王烏賊Architeuthis sanctipauli耳石中δ18O值，LANDMAN等[22]推算出其生活環(huán)境的水溫，在此基礎(chǔ)上結(jié)合歷史垂直水溫數(shù)據(jù)，又進一步推算出桑氏大王烏賊生活環(huán)境的平均水深。

耳石中C同位素多被應(yīng)用于頭足類的年齡和生長研究中，例如可以根據(jù)耳石中Δ14C在時間序列上產(chǎn)生的變化來建立年齡估算方程。

3 頭足類耳石的應(yīng)用

作為生命記錄儀，頭足類耳石記錄了其各個生命階段內(nèi)生活環(huán)境的特征，而耳石微量元素的改變反應(yīng)了水環(huán)境的變化。通過對頭足類耳石微結(jié)構(gòu)的分析，可以為研究頭足類種群分析、生長測定、年齡鑒定、洄游、繁殖、產(chǎn)卵期、產(chǎn)卵地的推算以及生活史和所生活過的環(huán)境打下基礎(chǔ)。

3.1 在頭足類年齡鑒定和生長研究中的應(yīng)用

頭足類動物的生長特性一直是生物學(xué)研究的重點，利用耳石來研究年齡和生長特性是一種可靠的方法。對耳石日輪進行準(zhǔn)確計數(shù)，推算出日生長量變化，進而估算個體生長快慢，再結(jié)合耳石日輪第一輪紋的出現(xiàn)時間就能鑒定出頭足類日齡。BIGELOWL[23]根據(jù)耳石輪紋特征推算出幼年鳶烏賊的生長曲線。頭足類的營養(yǎng)狀況也可以根據(jù)耳石來推斷，因為饑餓會使得耳石上生長輪的沉積率變慢，寬度變窄。發(fā)育階段的差異以及性別差異都會影響頭足類耳石的差異，利用耳石研究頭足類的生長需根據(jù)不同的模型，如線性模型、指數(shù)模型、logistic模型、冪函數(shù)方程模型、logarithmic模型等。因此不同種群或不同發(fā)育時期的同一種種群，其適用的生長模型往往都各不相同。利用耳石的日輪結(jié)構(gòu)，ARKHIPKIN等[24]發(fā)現(xiàn)地中海中部海域科氏滑柔魚春夏季孵化個體壽命僅有六個月左右，秋冬季孵化個體壽命比春夏季孵化個體壽命長約兩個多月。以同樣的方法，GONZALEZ等[25]研究了西班牙西北部阿根廷水域科氏滑柔魚的年齡和生長，測得雌性個體壽命比雄性個體壽命至少多2個月，雌性個體性成熟時間比雄性個體性成熟時間晚20～40 d。

3.2 在種群和群體鑒別中的應(yīng)用

近些年來，通過分析生物耳石微化學(xué)組成來鑒定海洋生物種群已成為一種新興手段。觀察并測量耳石的輪紋，再結(jié)合捕獲時間，便可推算出個體孵化時間，并根據(jù)不同的孵化時間進一步研究群體產(chǎn)卵季節(jié)[26]。ARGUELLES等[27]觀察秘魯海域莖柔魚外部形態(tài)特征參數(shù)以及耳石輪紋結(jié)構(gòu)，測量耳石日輪間的距離，分析種群間的關(guān)系，推測出秘魯海域莖柔魚的兩個種群分別在春夏季和秋冬季產(chǎn)卵，于秋冬季和次年春夏季增加漁業(yè)。ARKHIPKIN等[28]對不同地理群和不同季節(jié)產(chǎn)卵群的巴塔哥尼亞槍烏賊Loligo gahi進行研究，發(fā)現(xiàn)不同耳石中的微量元素含量有明顯差異，由此區(qū)分開地理分布不同的秋生群和春生群。

利用耳石進行種群鑒別是一種可行方法，同一物種不同種群或不同物種耳石的輪紋清晰度、透明度及對比度、日輪間的距離等方面都存在顯著性差異，而引起耳石差異的因素也有多種，平均水溫的波動、晝夜水溫的波動、食物條件的差異以及生命早期階段經(jīng)歷的事件。例如ALEXANDER[29]通過研究分布在不同海域的阿根廷滑柔魚，發(fā)現(xiàn)不同種群阿根廷滑柔魚的耳石清晰度以及輪紋的顏色存在著顯著性的差異；CHEN等[30]根據(jù)耳石形態(tài)特征參數(shù)和輪紋數(shù)的顯著性差異劃分出北太平洋柔魚存在兩個不同的地理種群，即東北太平洋柔魚種群和西北太平洋柔魚種群。

不同群體間耳石形態(tài)存在差異[31]，因此耳石形態(tài)結(jié)構(gòu)可作為種群劃分的依據(jù)之一。此外，耳石中微量元素的含量以及組成上的差異也可以用來進行區(qū)分種群。

3.3 在產(chǎn)卵、孵化期以及生活史歷程推算中的應(yīng)用

鑒定出日齡，結(jié)合整個胚胎發(fā)育所需時間以及幼體漂移方式、孵化時間、水域循環(huán)模式就可以推算出產(chǎn)卵場的位置和產(chǎn)卵時間等其它重要信息，經(jīng)統(tǒng)計分析后可確定該種群的繁殖期及繁殖高峰。此方法已經(jīng)應(yīng)用于阿根廷滑柔魚，研究發(fā)現(xiàn)它產(chǎn)卵時間主要集中在6-8月份[32]，烏拉圭和巴西交界處附近海域為其產(chǎn)卵地。對于柔魚科以及其它大部分開眼亞目動物而言，鑒定出日齡，可以用捕獲日期減去估算年齡所得的日期即為孵化日期，因為這些物種的生長紋在孵化后才開始沉積[2]，它們誕生時耳石為零輪。頭足類動物不同發(fā)育階段耳石微量元素含量不同，例如YATSU等[33]通過研究不同發(fā)育時期的柔魚Ommastrephes bartramii，發(fā)現(xiàn)胚胎期耳石中Ca、Sr元素的含量與其它發(fā)育期明顯不同。

耳石微量元素的特征對于生活史的研究和重現(xiàn)是必不可少的。對頭足類生物而言，耳石的微量元素特征依賴于周圍的海水，因此耳石包含其生命周期內(nèi)不斷變化的環(huán)境因素等信息。通過研究耳石及其周圍水環(huán)境中的微量元素，可有效地檢測種群的分布和種群遷移途徑、遷徙時間、以及遷徙速度。例如耳石日輪中Sr、Ca含量比可作為研究頭足類生活史水環(huán)境變化的指標(biāo)。IKEDA等[34]通過分析太平洋褶柔魚Todarodes pacificus耳石微量元素的含量及變化，推測出其生活環(huán)境溫度，他們還進一步推斷出兩種不同型體的群體有各自獨立的產(chǎn)卵場地和遷徙路徑。YATSU等[33]通過研究不同生長階段柔魚耳石中Sr的差異，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，個體生活環(huán)境溫度逐漸降低。對福氏槍烏賊Loligo forberi進行研究，發(fā)現(xiàn)不同生長階段耳石中Sr元素變化明顯，推斷主要原因是其生活環(huán)境經(jīng)歷過巨大變化。根據(jù)巴塔哥尼亞槍烏賊耳石中Cd/Ca和Ba/Ca元素含量比的變化，ARKHIPKIN等[35]推測出其冬季生活在深水環(huán)境中。ZUNHOLZ等[36]分析黵烏賊Gonatus fabricii耳石中的9種微量元素，證實了黵烏賊幼年期生活在表層水域而成年期生活在深層水域，并推測其成年后會洄游至冷水區(qū)域。RODHOUSE等[37]利用七星柔魚Martialia hyadesi耳石微量元素含量比及輪紋測量數(shù)據(jù)推斷其只在暖水區(qū)產(chǎn)卵。

3.4 在生活環(huán)境狀況重建中的應(yīng)用

利用耳石所含化學(xué)元素研究頭足類生活過的環(huán)境條件，借助同位素分析技術(shù)和微探針等重現(xiàn)頭足類生活史，這便是生活環(huán)境狀況的重建研究，不同流域或棲息地，耳石中這些元素的含量具有差異性。例如，對西格陵蘭島黵烏賊耳石中9種微量元素的含量分析，發(fā)現(xiàn)耳石不同區(qū)域微量元素的含量的變化有效地提供了黵烏賊的遷徙及棲息地等生活史信息。通過研究不同海流對耳石元素沉積的作用，RIBERGAAR等[38]發(fā)現(xiàn)暖海流和冷海流所起到的影響不同。

Sr、Fe、Zn等元素被視為重建頭足類生活水域溫度的指標(biāo)，通過研究不同生長階段個體耳石的微量元素含量及比值的變化來探索其經(jīng)歷的水溫變化。IKEDA等[39]通過研究哥斯達黎加和秘魯海域的莖柔魚，發(fā)現(xiàn)厄爾尼諾與非厄爾尼諾年間其耳石中Sr/Ca無明顯差異，由此推測出這與莖柔魚成體晝夜垂直移動致使生活區(qū)域水溫發(fā)生改變相關(guān)。ARKHIPKIN等[28]研究發(fā)現(xiàn)巴塔哥尼亞槍鳥賊生活環(huán)境水溫對鎂（Mg）/Ca有影響，且呈正相關(guān)。通過研究北太平洋柔魚耳石中的Sr/Ca，YATSU等[33]推測北太平洋柔魚可能在處于亞熱帶的產(chǎn)卵場和處于亞北極區(qū)餌料場間進行季節(jié)性洄游。

IKEDA等[36]對不同水溫區(qū)域太平洋褶柔魚耳石中的Sr含量研究，發(fā)現(xiàn)Sr元素在冷水區(qū)比暖水區(qū)更容易沉積到耳石中。對生活在不同氣候區(qū)域的柔魚進行研究，同樣發(fā)現(xiàn)Sr元素在氣候冷的地區(qū)更容易被吸收。例如生活在亞熱帶的太平洋褶柔魚和柔魚比生活在熱帶的中國槍烏賊、劍尖槍烏賊、杜氏槍烏賊和萊氏擬烏賊[40]耳石中的Sr含量高，生活于溫帶的柔魚明顯比生活在亞熱帶的莖柔魚和鳶烏賊[41]耳石中Sr含量高。

4 展望

隨著國內(nèi)外對頭足類動物研究的逐漸深入，頭足類耳石結(jié)構(gòu)的研究也必將成為日后的熱門課題。與以往不同的是，其研究范圍也不僅僅局限于結(jié)構(gòu)的分析、元素的分布，更多的研究將是針對耳石在漁業(yè)管理和生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用。目前耳石輪紋在推算年齡、生長特性以及種群鑒別等方面扮演重要角色，而耳石微量元素和同位素研究在種群劃分、生活環(huán)境重建等方面得到了很好的應(yīng)用。同樣耳石中化學(xué)元素也可以來研究水環(huán)境的污染狀況，以及與水體富營養(yǎng)化。

頭足類耳石的生長過程受到許多生物因素和非生物因素的影響，然而這些影響能間接反映它們生活環(huán)境的變化，這也為研究海洋生態(tài)系統(tǒng)提供了一種新的方法。隨著NanoSIMS等方法被應(yīng)用到頭足類耳石的化學(xué)微觀結(jié)構(gòu)研究中，我們已得到有關(guān)鈣化過程和個體生活史的新信息。然而在研究過程中，耳石研究方法、數(shù)據(jù)處理分析等方面還有待改善和提高，我們要不斷創(chuàng)新研究方法，讓耳石結(jié)構(gòu)得到更廣泛的應(yīng)用。

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