殷瀟凡　徐俊　谷輝杰　吳旭華　劉建興　陳炯　宗陽銘

(上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院，上?！?01199)

·論著·

細(xì)胞內(nèi)Zn內(nèi)流減少在低氧保護(hù)髓核細(xì)胞中的作用及其機(jī)制

殷瀟凡徐俊谷輝杰吳旭華劉建興陳炯宗陽銘

(上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院，上海201199)

摘要目的：探討細(xì)胞內(nèi)Zn2+的濃度在低氧調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞表達(dá)金屬蛋白酶(metalloproteinases, MMPs)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的作用及其機(jī)制。方法： 從SD大鼠中提取髓核細(xì)胞后首先進(jìn)行平面培養(yǎng)，然后用藻酸鈉凝膠進(jìn)行三維培養(yǎng)。采用FluoZin-3 AM染色法檢測細(xì)胞內(nèi)Zn2+的濃度(intracellular Zn2+concentration， [Zn2+]i)；采用阿利新藍(lán)染色分析細(xì)胞分泌蛋白多糖的含量，采用二甲基亞甲藍(lán)分光光度法(DMMB)檢測糖胺聚糖的表達(dá)水平，采用real-time PCR分析II型膠原(α1 type II collagen，COL2A1)、金屬蛋白酶13 (matrix metalloproteinase 13，MMP-13)和解整合素樣金屬蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin motif 5，ADAMTS-5)mRNA的表達(dá)。通過免疫組化法和Western印跡法分析鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8(ZRT,IRT-like protein 8,ZIP8)的表達(dá)水平。結(jié)果： IL-1β和ZnCl2可以顯著提高髓核細(xì)胞內(nèi)的[Zn2+]i，但是該作用可以被低氧所抑制。在藻酸鈉三維培養(yǎng)的髓核細(xì)胞中，低氧可以顯著改善IL-1β和ZnCl2引起的蛋白多糖、糖胺聚糖和COL2A1 mRNA的降低，但ZnCl2可以抑制低氧的保護(hù)作用。細(xì)胞內(nèi)Zn2+的螯合劑和低氧可以抑制MMP-13 mRNA水平的升高。IL-1β和ZnCl2促進(jìn)髓核細(xì)胞中ZIP8的表達(dá)升高，但是低氧可抑制ZIP8的表達(dá)。結(jié)論： 低氧可以調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞中Zn2+的內(nèi)流，Zn2+介導(dǎo)了低氧對髓核細(xì)胞中MMP-13和ECM的調(diào)節(jié)作用。[Zn2+]i的變化可能參與了椎間盤退變的過程。

關(guān)鍵詞鋅；低氧；髓核細(xì)胞；代謝

中圖分類號R681.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

Effect and Mechanism of Decreasing Intracellular Zn2+Influx in the Hypoxia Protection of Nucleus Pulposus CellsYINXiaofanXUJunGUHuijieWUXuhuaLIUJianxingCHENJiongZONGYangming

CentralHospitalofMinghangDistrict,Shanghai201199,China

AbstractObjective： To explore the effect and mechanism of intracellular Zn2+concentration ([Zn2+]i) in hypoxia-induced regulation of metalloproteinases (MMPs) and extracellular matrix (ECM) expression in nucleus pulposus (NP) cells. Methods： NP cells from SD rats received plate culture at first and then three-dimensional culture with sodium alginate gel. [Zn2+]i was assayed by FluoZin-3 AM staining. Proteoglycan was assayed by Alcian blue staining. Glycosaminoglycan was detected by 1,9-dimethylmethylene blue (DMMB) assay. And real-time PCR were used to assay the mRNA expression of α1 type II collagen (COL2A1), matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) and a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin motif 5 (ADAMTS-5). The expression of ZRT,IRT-like protein 8(ZIP8) was assayed by immunohistochemistry and Western blotting. Results： Interleukin (IL)-1β and ZnCl2could significantly increase the [Zn2+]i of NP cells, however, the effect could be inhibited by hypoxia. Hypoxia did significantly attenuate the decrease of proteoglycan, glycosaminoglycan, and COL2A1 mRNA, which was induced by IL-1β and ZnCl2treatment, in sodium alginate three-dimensional culture. However, ZnCl2inhibited the protective effect of hypoxia. Both an intracellular Zn2+chelator and hypoxia could inhibit the increase of MMP-13 mRNA expression. IL-1β and ZnCl2treatment promoted the increase of ZIP8 expression in NP cells, however, hypoxia inhibited ZIP8 expression. Conclusions： Hypoxia may regulate the Zn2+influx in NP cells. Zn2+mediates the regulation effect of hypoxia on ECM and MMP-13. Perhaps the changes of [Zn2+]i are involved in the process of intervertebral disc degeneration.

Key WordsZinc;Hypoxia;Nucleus pulposus cells;Metabolism

有關(guān)椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，目前尚不明確[1-2]。許多潛在致病因素均可引起椎間盤中代謝平衡失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解。椎間盤中主要的ECM包括Ⅱ型膠原和蛋白多糖，而金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和解整合素樣金屬蛋白酶(disintegrins and metalloproteinases with thrombospondin motifs，ADAMTSs)是降解ECM的主要蛋白酶[3]。MMP-1、 MMP-2、 MMP-3、 MMP-7、 MMP-8、 MMP-10和MMP-13以及ADAMTS-1、ADAMTS-4和ADAMTS-5在退變椎間盤中的表達(dá)水平高于正常椎間盤。在本研究中，我們主要分析MMP-13和ADAMTS-5。

哺乳動物的MMPs包含1個保守結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)包括自我抑制的前結(jié)構(gòu)域和1個催化結(jié)構(gòu)域[4]。其中，催化結(jié)構(gòu)域包含1個催化的Zn2+、1個結(jié)構(gòu)性的Zn2+和3個典型的Ca2+；前結(jié)構(gòu)域包含1個保守的半胱氨酸的開關(guān)結(jié)構(gòu)[5]。當(dāng)MMPs失活的時候，Zn2+的活性區(qū)域會被結(jié)合從而抑制半胱氨酸的活性；當(dāng)MMPs激活的時候，Zn2+與半胱氨酸的交互作用則被打亂[5]。因此，Zn2+在MMPs介導(dǎo)的基質(zhì)降解過程中十分重要。近來發(fā)現(xiàn)，Zn2+與骨關(guān)節(jié)炎患者中MMPs介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程密切相關(guān)[6]。然而，對于Zn2+在椎間盤細(xì)胞代謝中的作用，目前尚知之甚少。

低氧是椎間盤代謝的重要特點(diǎn)。由于椎間盤缺乏血液供應(yīng)，椎間盤髓核中氧分壓僅0.5 kPa，髓核細(xì)胞處于乏氧的狀態(tài)。但是，低氧對髓核細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，低氧可以提高髓核細(xì)胞中蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)水平。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，低氧可以減少胰腺β細(xì)胞中Zn2+的內(nèi)流。但是，在髓核細(xì)胞中低氧與Zn2+的關(guān)系尚不明確，本文旨在對此作一探討。

1資料與方法

1.1實(shí)驗試劑與耗材3周大小250 g左右的SD大鼠購自復(fù)旦大學(xué)動物科學(xué)部。鈣離子熒光探針FluoZin-3 AM購買自美國Invitrogen生命技術(shù)公司，ZIP8一抗購自美國Proteintech公司，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、Pluronic F-127、鋅離子螯合劑TPEN[N,N,N′,N′-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine]、DMB(1,9-dimethylmethylene blue),硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)和阿利新藍(lán)染液購自美國Sigma公司。所有有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)的試劑均購自美國 Gibco 公司。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1髓核細(xì)胞的培養(yǎng)參考已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)[8]，在顯微鏡下將膠凍樣的髓核組織從大鼠的腰椎間盤中取出并在0.1%的Ⅱ型膠原酶中消化4 h，然后經(jīng)70 μm的濾器過濾。用高糖的含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)髓核細(xì)胞。平面培養(yǎng)兩代后，將髓核細(xì)胞消化后進(jìn)行三維培養(yǎng)。

1.2.2藻酸鈉三維培養(yǎng)為了避免髓核細(xì)胞的去分化，將髓核細(xì)胞培養(yǎng)在藻酸鈉凝膠中。將1×106/mL的細(xì)胞重懸在1.2%的低黏度的藻酸鈉氯化鈉溶液中(藻酸鈉溶于150 mmol/L的氯化鈉溶液中)。用22G的注射器將上述細(xì)胞懸液逐滴滴加在200 mmol/L的CaCl2溶液中。30 min后，藻酸鈉發(fā)生聚化，形成球形的小珠子，然后用150 mmol/L的氯化鈉溶液和DMEM清洗，清洗后在24孔板中培養(yǎng)。

當(dāng)需要將髓核細(xì)胞從凝膠中釋放出來進(jìn)行實(shí)驗時，將凝膠在2.2%的枸櫞酸鈉溶液中37℃孵育10 min，然后用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化5 min并離心，即可得到細(xì)胞團(tuán)。

1.2.3實(shí)驗設(shè)計為了達(dá)到低氧狀態(tài),將水凝膠中的髓核細(xì)胞培養(yǎng)在三氣培養(yǎng)箱,充氮?dú)庖跃S持1%O2的低氧狀態(tài)。用100 μmol/L ZnCl2和(或)10 ng/mL IL-1β處理髓核細(xì)胞24 h。用TPEN螯合游離的Zn2+時，在加ZnCl2和IL-1β前2 h加入TPEN。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)Zn2+水平的測量采用FluoZin-3 AM染色法測定細(xì)胞內(nèi)的鋅離子濃度(intracellular Zn2+concentration， [Zn2+]i)。在玻璃培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的髓核細(xì)胞加2 μmol/L FluoZin-3和0.1% Pluronic F-127后，在37℃中孵育37 min，進(jìn)行Zn2+的加載。然后用D-Hanks清洗細(xì)胞后再孵育20 min。使用倒置的共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長為490 nm和發(fā)射波長為530 mm的條件下觀察髓核細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。為了進(jìn)行半定量分析，將髓核細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中，經(jīng)上述處理后用多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司；型號：Flex Station3)采集各組的熒光強(qiáng)度。

1.2.5組織學(xué)檢測藻酸鈉水凝膠珠子用4%的多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋后切成4 μm厚的切片。將阿利新藍(lán)8GX溶解在冰醋酸中，配成1%溶液。室溫下用此溶液孵育凝膠切片30 min。用 0.1%的核固紅反染20 s后進(jìn)行梯度脫水。然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍后在光學(xué)顯微鏡下觀察。同時，對切片進(jìn)行HE (hematoxylin-eosin)染色和甲苯胺藍(lán)染色。

1.2.6免疫組化和細(xì)胞免疫熒光采用免疫組化法或者免疫熒光法觀察大鼠的椎間盤、平面培養(yǎng)的細(xì)胞和三維培養(yǎng)的髓核細(xì)胞中ZIP-8的表達(dá)水平。取大鼠尾椎Co6～7，在10%甲醛中固定2 d，然后在10%乙二胺四乙酸 (ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)中脫鈣1個月。將椎間盤切片后與藻酸鈉凝膠切片一同進(jìn)行脫蠟和脫水，用3%雙氧水孵育20 min，在檸檬酸鈉緩沖液中加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。用含0.1%Triton X-100的5%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉1 h后，將細(xì)胞及切片加ZIP8一抗(1∶200)后4℃孵育過夜。最后，切片加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗后常溫下孵育2 h，并用蘇木素反染；而細(xì)胞則加入由異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗后暗室中孵育2 h，并用二脒基苯基吲哚(DAPI)染核。細(xì)胞和切片在分別使用倒置熒光顯微鏡和正置顯微鏡進(jìn)行觀察(日本Olympus公司)。

1.2.7糖胺聚糖產(chǎn)量的檢測采用二甲基亞甲藍(lán)分光光度法(DMMB法) 分析培養(yǎng)基中糖胺聚糖(glycosaminoglycan， GAG)的產(chǎn)量。實(shí)驗設(shè)計中的處理完成后，收集培養(yǎng)基并使用離心濾器(美國Millipore公司；型號：Centricon YM-50)以5300 r/min速度離心30 min。

1.2.8Western印跡提取細(xì)胞的總蛋白時，將含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液加入到三維培養(yǎng)后從藻酸鈉凝膠中提取的髓核細(xì)胞中，采用二喹啉甲酸(BCA)法分析總蛋白的濃度。配置好SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)膠后，將總蛋白上樣，上樣量為50 mg。電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF(polyvinylidene difluoride)膜。用5%的脫脂奶粉封閉2 h，然后加ZIP8和β-actin (1∶1000)的一抗4℃孵育過夜。用TBST(Tris-buffered saline with Tween)洗膜3次后，用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗在常溫下孵育2 h，清洗后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光曝光儀(美國PerkinElmer公司)進(jìn)行觀察。采用AlphaEaseFC 4.0 software對條帶進(jìn)行半定量分析。

1.2.9Real-time PCR采用TRIzol法提取總RNA并測量濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(立陶宛 MBI Fermantas 公司)將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用Mastercycler○Rep realplex(德國Eppendorf公司)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR，PCR引物如表1所示。20 μL的PCR反應(yīng)混合物包括2 μL的2倍稀釋的cDNA, 10 μL SYBR PremixEx Taq Ⅱ, 0.2 μL引物，用去離子水補(bǔ)足。反應(yīng)程序為50℃ 2 min；95℃ 30 s； 95℃ 5 s， 40個循環(huán)； 60℃ 34 s。獲取Ct(cycle threshold)后，用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因進(jìn)行校正。mRNA的相對水平采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用Graphpad Prism5 和SPSS 19 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組之間參數(shù)的比較采用方差分析；如果有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Tukey’s test進(jìn)行兩兩之間的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1低氧降低髓核細(xì)胞中Zn2+的濃度在20%的常氧環(huán)境下，ZnCl2和IL-1β 可顯著提高髓核細(xì)胞中的[Zn2+]i(P<0.05)，見圖 1A、 1B。采用同樣的ZnCl2和IL-1β處理條件，在1%低氧環(huán)境下髓核細(xì)胞中的[Zn2+]i明顯小于常氧環(huán)境時(P<0.05)，提示低氧可以抑制髓核細(xì)胞中的Zn2+水平。在低氧環(huán)境中，ZnCl2和IL-1β協(xié)同作用下髓核細(xì)胞中的[Zn2+]i明顯大于ZnCl2和IL-1β單獨(dú)作用時的水平。

A：熒光顯微鏡下髓核細(xì)胞中的[Zn2+]i；B：A圖的半定量分析,*P<0.05,**P<0.01

圖1髓核細(xì)胞中的[Zn2+]i

2.2[Zn2+]i的變化參與低氧引起的三維培養(yǎng)髓核細(xì)胞中ECM的改變?nèi)鐖D2A～D所示，培養(yǎng)在直徑為2～4 mm的珠子狀的凝膠中，髓核細(xì)胞仍然維持著類軟骨的特性(圖2E～H)。阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示，與常氧相比較，低氧可以提高髓核細(xì)胞中蛋白多糖的產(chǎn)量(圖2I)。更重要的是， 低氧條件下ZnCl2處理后的髓核細(xì)胞中的蛋白多糖明顯多于常氧條件下同樣處理的髓核細(xì)胞，提示低氧可以緩解ZnCl2引起的ECM的降解。

采用DMMB和real-time PCR分析糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型膠原(α1 type Ⅱ collagen，COL2A1) mRNA的變化。相對常氧環(huán)境，低氧能顯著提高經(jīng)ZnCl2和IL-1β處理后的髓核細(xì)胞中的GAG和COL2A1 mRNA的表達(dá)(圖2J、 2K,P<0.05)。低氧可以提高經(jīng)IL-1β處理的髓核細(xì)胞中的GAG和COL2A1 mRNA的表達(dá)，但這種作用可以被ZnCl2所抑制，這提示ZnCl2引起的Zn2+內(nèi)流甚至可以逆轉(zhuǎn)低氧對髓核細(xì)胞的保護(hù)作用。

A～H：髓核細(xì)胞的藻酸鈉三維培養(yǎng)；I：髓核細(xì)胞的阿利新藍(lán)染色；J：髓核細(xì)胞中糖胺聚糖產(chǎn)量的檢測；K：髓核細(xì)胞中COL2A1的mRNA的表達(dá)；*P<0.05,**P<0.01

圖2三維培養(yǎng)的髓核細(xì)胞的大體圖片、阿利新藍(lán)染色、DMMB分析以及COL2A1 mRNA的表達(dá)

2.3[Zn2+]i的變化參與低氧引起的三維培養(yǎng)髓核細(xì)胞中MMPs的改變由于MMPs和ADAMTSs是降解髓核ECM的主要蛋白酶，因此，我們也分析了[Zn2+]i對它們的作用。相對于常氧，低氧抑制了IL-1β引起的MMP-13和ADAMTS-5 mRNA水平的升高， 但該作用會被IL-1β 和ZnCl2協(xié)同作用逆轉(zhuǎn)(圖3A,P<0.05)。TPEN是一種膜通透性的Zn2+的螯合劑。與低氧的作用相似，TPEN也可以顯著抑制ZnCl2引起的髓核細(xì)胞中MMP-13 mRNA表達(dá)的升高(圖3B，P<0.05)。然而，較為奇怪的是，Zn2+內(nèi)流的單獨(dú)作用并不能調(diào)節(jié)ADAMTS-5的表達(dá)。

2.4ZIP8的表達(dá)及在低氧和IL-1β作用下的變化由于ZIP8介導(dǎo)了軟骨細(xì)胞中Zn2+的內(nèi)流，因此，我們就其在髓核細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。免疫組化和免疫熒光顯示，在髓核組織和培養(yǎng)的髓核細(xì)胞中，細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中均有ZIP8表達(dá)(圖4A～F)。ZnCl2提高了藻酸鈉凝膠中的髓核細(xì)胞中ZIP8的表達(dá)(圖4G)。IL-1β使髓核細(xì)胞中ZIP8表達(dá)增加，且有劑量依賴作用(圖4G)。不論IL-1β處理與否，低氧均可抑制ZIP8的表達(dá)，體現(xiàn)了ZIP8在低氧抑制[Zn2+]i中的作用(4H、I)。

A～F：髓核組織中、平面培養(yǎng)以及三維培養(yǎng)的髓核細(xì)胞中ZIP8的表達(dá)；G：IL-1β作用下髓核細(xì)胞中ZIP8的表達(dá)；H：IL-1β以及低氧下髓核細(xì)胞中ZIP8的表達(dá)；I：H中相對量的分析。*P<0.05,**P<0.01

圖4ZIP8在髓核組織和髓核細(xì)胞中的表達(dá)以及低氧和IL-1β對ZIP8表達(dá)的影響

3討論

與機(jī)體中的其他細(xì)胞不同，髓核細(xì)胞更傾向于生活在低氧的環(huán)境中；在低氧環(huán)境中髓核細(xì)胞的活性和ECM的代謝平衡更加穩(wěn)定[9]。雖然通常認(rèn)為缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)和缺氧誘導(dǎo)因子2α(hypoxia-inducible factor 2α，HIF-2α)介導(dǎo)了低氧的作用，但仍有研究者持不同見解[10]；而且有關(guān)HIF對ECM的確切作用目前仍然未知，可能有其他的介質(zhì)介導(dǎo)了低氧的作用。本研究證明，細(xì)胞內(nèi)Zn2+的水平變化可能是低氧調(diào)節(jié)ECM的重要因素。

在正常生理狀況下，Zn2+的平衡與骨骼生長、胚胎發(fā)育以及神經(jīng)和免疫系統(tǒng)密切相關(guān)[11-12]。在骨關(guān)節(jié)中，Zn2+與軟骨細(xì)胞的凋亡和ECM的重塑相關(guān)[6, 13]。在髓核細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)Zn2+的內(nèi)流可以引起MMPs的升高和ECM的降解，這提示細(xì)胞內(nèi)Zn2+的變化可能參與椎間盤的退變。我們還發(fā)現(xiàn)，ZnCl2和 IL-1β可引起[Zn2+]i 和ZIP8表達(dá)的升高。由于IL-1β是公認(rèn)的引起椎間盤分解代謝的因子，因此，Zn2+的內(nèi)流可能介導(dǎo)了IL-1β對椎間盤的作用，而ZIP8可能介導(dǎo)了IL-1β引起的Zn2+的內(nèi)流。

細(xì)胞內(nèi)游離的Zn2+主要由多種Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中ZIP14 (SLC39A14) 和ZIP13 (SLC39A13)調(diào)節(jié)生長板中細(xì)胞Zn2+的內(nèi)流，而ZIP8則參與軟骨細(xì)胞中Zn2+的內(nèi)流[11, 14]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以抑制ZIP8的表達(dá)。因此，我們推測低氧可能通過抑制ZIP8蛋白的表達(dá)來抑制Zn2+的內(nèi)流，有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

由于Zn2+是MMPs的重要組成成分，故細(xì)胞內(nèi)Zn2+水平的改變可以調(diào)節(jié)MMP-13和ECM，這也符合邏輯。但是，我們發(fā)現(xiàn)，ZnCl2單獨(dú)處理髓核細(xì)胞并不足以引起細(xì)胞中ADAMTS-5表達(dá)的增加，這與之前報道的結(jié)果相一致[6]。然而，ZnCl2和IL-1β的協(xié)同作用可以引起ADAMTS-5的改變，這說明Zn2+對ADAMTS-5的作用小于對MMP-13的作用。

在平面培養(yǎng)的條件下，髓核細(xì)胞容易出現(xiàn)去分化的現(xiàn)象，伴隨著Ⅱ型膠原和蛋白多糖等細(xì)胞表型的表達(dá)降低；而用藻酸鈉凝膠進(jìn)行的三維培養(yǎng)可以顯著抑制髓核細(xì)胞的去分化[15]。

綜上所述，低氧抑制髓核細(xì)胞中Zn2+的內(nèi)流，這可能介導(dǎo)了MMP合成的減少和ECM的降解。Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)體ZIP8也由低氧進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此，ZIP8可能介導(dǎo)了低氧狀態(tài)Zn2+內(nèi)流的抑制。這些結(jié)果說明，細(xì)胞內(nèi)Zn2+水平的變化可能是將來防治椎間盤退變的一個潛在的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Sakai D, Grad S. Advancing the cellular and molecular therapy for intervertebral disc disease[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 84:159-171.

[2]Fontana G, See E, Pandit A. Current trends in biologics delivery to restore intervertebral disc anabolism[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015, 84:146-158.

[3]Vo NV, Hartman RA, Yurube T, et al. Expression and regulation of metalloproteinases and their inhibitors in intervertebral disc aging and degeneration[J]. Spine J, 2013,13(3): 331-341.

[4]Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z. Matrix metallo-proteinases and the regulation of tissue remodelling[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007,8(3): 221-233.

[5]Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry[J]. Circ Res, 2003,92(8): 827-839.

[6]Kim JH, Jeon J, Shin M, et al. Regulation of the catabolic cascade in osteoarthritis by the zinc-ZIP8-MTF1 axis[J]. Cell, 2014,156(4): 730-743.

[7]Gerber PA, Bellomo EA, Hodson DJ, et al. Hypoxia lowers SLC30A8/ZnT8 expression and free cytosolic Zn2+in pancreatic beta cells[J]. Diabetologia, 2014,57(8): 1635-1644.

[8]江立波, 張小磊, 徐華梓, 等. 細(xì)胞自噬對饑餓環(huán)境下椎間盤髓核細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012,28(7): 1302.

[9]Chen JW, Li B, Yang YH, et al. Significance of hypoxia in the physiological function of intervertebral disc cells[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2014,24(3): 193-204.

[10]Gogate SS, Nasser R, Shapiro IM, et al. Hypoxic regulation of beta-1,3-glucuronyltransferase 1 expression in nucleus pulposus cells of the rat intervertebral disc: role of hypoxia-inducible factor proteins[J]. Arthritis Rheum, 2011,63(7): 1950-1960.

[11]Fukada T, Hojyo S, Furuichi T. Zinc signal: a new player in osteobiology[J]. J Bone Miner Metab, 2013,31(2): 129-135.

[12]Fukada T, Yamasaki S, Nishida K, et al. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling[J]. J Biol Inorg Chem, 2011,16(7): 1123-1134.

[13]Sauer GR, Smith DM, Cahalane M, et al. Intracellular zinc fluxes associated with apoptosis in growth plate chondrocytes[J]. J Cell Biochem, 2003,88(5): 954-969.

[14]Hojyo S, Fukada T, Shimoda S, et al. The zinc transporter SLC39A14/ZIP14 controls G-protein coupled receptor-mediated signaling required for systemic growth[J]. PLoS One, 2011,6(3): e18059.

[15]Rastogi A, Thakore P, Leung A, et al. Environmental regulation of notochordal gene expression in nucleus pulposus cells[J]. J Cell Physiol, 2009,220(3): 698-705.

通訊作者宗陽銘，E-mail：18918169029@189.cn