劉志強　徐振東　沈富毅　張玥琪　李海冰

(同濟大學附屬第一婦嬰保健院麻醉科，上?！?00040)

·論著·

異氟烷宮內(nèi)暴露對胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

劉志強徐振東沈富毅張玥琪李海冰

(同濟大學附屬第一婦嬰保健院麻醉科，上海200040)

摘要目的：觀察異氟烷宮內(nèi)暴露對胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響。方法： 將妊娠19 d的SD大鼠隨機分為異氟烷麻醉組(I組)和對照組(C組)，I組孕鼠接受3 h的1.3%異氟烷吸入麻醉，C組吸入空氣。采用原位末端標記法(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)觀察胎鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元在異氟烷暴露結(jié)束后0、3 h和9 h時間點的凋亡情況。結(jié)果： I組和C組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元在異氟烷暴露后0、3 h和9 h均見凋亡；2組異氟烷暴露后0 h和3 h凋亡指數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，暴露后9 h凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論： 1.3%異氟烷宮內(nèi)暴露不會加重胎鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡，在暴露后早期反而有減緩作用，提示胎兒期可能不是異氟烷發(fā)育神經(jīng)毒性的易損期。

關(guān)鍵詞異氟烷；宮內(nèi)暴露；凋亡；海馬神經(jīng)元

中圖分類號R329.2+5

文獻標識碼A

Effect of In-Utero Exposure to Isoflurane on Apoptosis of Hippocampal Neuron in Fetal RatsLIUZhiqiangXUZhendongSHENFuyiZHANGYueqiLIHaibing

DepartmentofAnesthesiology,ShanghaiFirstMaternityandInfantHospital,TongjiUniversity,Shanghai200040,China

AbstractObjective： To observe the effect of in-utero exposure to isoflurane on apoptosis of hippocampal neuron in fetal rats. Methods： SD rats at gestational day 19 were randomly assigned into the isoflurane anesthesia group(group I) and the control group(group C). The rats in group I were exposed to 1.3% isoflurane for 3 h,while group C were exposed to air. The Apoptosis status of neurons in hippocampal CA1 region of fetal brains were observed by using TdT mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) 0 h,3 h, and 9 h after exposure to isoflurane. Results： There were a certain amount of apoptotic neurons in hippocampal CA1 region in both group I and group C 0 h,3 h,and 9 h after the exposure.There were significant differences regarding apoptosis index(AI) 0 h and 3 h after the exposure between the two groups (P<0.05). However, there was no significant difference regarding the AI between the two groups 9 h after the exposure (P>0.05). Conclusions： The in-utero exposure to 1.3% isoflurane does not increase the apoptosis of neurons in hippocampal CA1 region of fetal rats. Furthermore, it may alleviate the apoptosis during the early period.The result suggests that fetus period may not be the vulnerable period for isoflurane-induced neurotoxicity.

Key WordsIsoflurane；In-utero exposure；Apoptosis；Hippocampal neuron

研究[1]發(fā)現(xiàn)，麻醉藥可導致幼年動物大腦神經(jīng)元過量凋亡，干擾突觸的發(fā)育和塑形，影響神經(jīng)元細胞骨架的正常形成及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的發(fā)育和成熟等，并可能造成持續(xù)至成年階段的神經(jīng)認知能力削弱。與出生后的幼年動物接受全身麻醉不同，胎兒大腦處于發(fā)育的更早期，在其未脫離母體環(huán)境的情況下受到全身麻醉藥的暴露是否會引發(fā)上述改變值得探究。本研究通過使孕鼠吸入異氟烷造成胎鼠大腦的宮內(nèi)暴露，觀察胎鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元不同時間點的凋亡狀況，以明確以異氟烷為代表的全身麻醉藥對胎兒期大腦組織形態(tài)的影響，為進一步了解其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期學習記憶能力的影響及機制提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1實驗動物及分組清潔級健康成年SD大鼠，16周齡左右，體質(zhì)量(250±50)g，由華東師范大學腦功能基因組學研究所動物實驗中心提供。大鼠實驗前籠內(nèi)適應性喂養(yǎng)1周，將發(fā)情雌鼠與雄鼠按 2∶1 比例合籠，觀察到陰栓即為妊娠第1天并記錄。選取18只孕鼠，于妊娠第19天開始進行實驗，隨機分為異氟烷組(I組)和對照組(C組)，每組各9只。

1.2試劑異氟烷由美國雅培公司產(chǎn)品生產(chǎn)；原位末端標記法(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測試劑盒由瑞士羅氏公司生產(chǎn)。IMS細胞圖像分析系統(tǒng)由上?；鶢栴D生物科技有限公司提供。其余實驗試劑均由同濟大學附屬第一婦嬰保健院中心實驗室配制。

1.3方法孕鼠麻醉過程在自制麻醉箱中進行，術(shù)前禁食6 h，不禁水。麻醉期間保持麻醉箱內(nèi)溫度在37～38 ℃。以氧氣作為載氣，使異氟烷通過麻醉揮發(fā)罐后進入箱內(nèi)。待異氟烷達到預定濃度1.3%后，將鼠放置于麻醉箱上部隔板上。待其被麻醉，快速將嬰兒脈搏血氧飽和度(saturation of pulse oxygen，SpO2)帶狀探頭環(huán)繞于孕鼠腹部，持續(xù)監(jiān)測SpO2。氣體取樣接頭處接麻醉監(jiān)護儀，監(jiān)測箱內(nèi)麻醉氣體濃度、氧濃度和二氧化碳濃度。調(diào)整氧流量，維持吸入氧濃度30%。調(diào)整揮發(fā)罐刻度和氧氣流量，維持異氟烷濃度于1.3%，持續(xù)吸入3 h。麻醉過程中，注意觀察孕鼠皮膚顏色和呼吸情況，間斷予以翻身，保持孕鼠SpO2>90%。C組孕鼠置于同型麻醉箱內(nèi)，吸入空氣，時間同為3 h。

1.4標本的采集和處理2組孕鼠接受異氟烷麻醉或空氣吸入后，在暴露結(jié)束后0 h(麻醉結(jié)束即刻)、3 h和9 h 3個時間點，各隨機選取3只孕鼠，腹腔注射苯巴比妥(100 mg/kg)麻醉后立即剖宮產(chǎn)。從每只孕鼠子宮中隨機取出體質(zhì)量均勻的胎鼠2只(各時間點每組共6只)。將胎鼠迅速移至超凈臺冰盒上，解剖鏡下暴露心臟，左心室經(jīng)4 ℃ 0.9%氯化鈉液、4%多聚甲醛慢灌注固定。隨后，迅速分離出大腦海馬組織，于4℃下置入4%多聚甲醛內(nèi)固定12 h，再置入50%乙醇中浸泡4～5 h，常規(guī)石蠟包埋，作連續(xù)冠狀切片(5 μm)備用。抽取2組暴露后0 h孕鼠的左心室血液100 μL，備做動脈血氣和血糖檢測。

1.5TUNEL法檢測海馬神經(jīng)元凋亡嚴格按照TUNEL試劑盒說明書操作，每只胎鼠取3張切片，于高倍鏡下(×400)選取海馬CA1區(qū)神經(jīng)元6個視野攝影，使用IMS細胞圖像分析系統(tǒng)進行分析，讀取凋亡細胞數(shù)，取平均值并計算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。TUNEL凋亡細胞為散在分布、染色不均勻、細胞核中有棕黃色顆粒者。AI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

2結(jié)果

2.1孕鼠動脈血氣分析及血糖結(jié)果異氟烷麻醉暴露期間全部孕鼠未出現(xiàn)明顯呼吸停止、缺氧、二氧化碳蓄積等改變。2組孕鼠暴露后0 h動脈血pH值、動脈氧分壓、動脈二氧化碳分壓及血糖等差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均大致正常，可排除由于麻醉引起的母體低氧、低血糖等不良反應導致胎鼠的神經(jīng)系統(tǒng)損害，見表1。

2.2TUNEL染色和AI結(jié)果在暴露結(jié)束后的各時間點2組胎鼠的海馬CA1區(qū)均見一定數(shù)量的凋亡細胞，見圖1。Ⅰ 組在暴露后0 h和3 h AI明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，2組暴露后9 h AI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

A：C組暴露后0 h；B：C組暴露后3 h；C：C組暴露后9 h；D：I組暴露后0 h；E：I組暴露后3 h；F：I組暴露后9 h

圖12組孕鼠宮內(nèi)暴露后不同時間點胎鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況(TUNEL法，×400)

與C組同時間點比較，*P<0.05

圖22組孕鼠宮內(nèi)暴露后不同時間點胎鼠海馬

CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)(AI)比較

3討論

1.3%異氟烷吸入濃度被認為是孕鼠的最低肺泡氣濃度(比人類略低)，吸入該濃度的異氟烷可對孕鼠產(chǎn)生全身麻醉作用，并且母體與胎鼠的腦內(nèi)濃度基本一致[2]。

Jevtovic-Todorovic等[3]首次發(fā)現(xiàn)以異氟烷為代表的全身麻醉藥會造成幼年動物大腦神經(jīng)元的過度凋亡，造成神經(jīng)元密度減少和認知功能減弱，而嚙齒類新生動物對這種神經(jīng)退化作用特別敏感。后續(xù)的研究[4]證實，全身麻醉藥可以引起包括靈長目動物在內(nèi)的發(fā)育期動物大腦的神經(jīng)退行性改變，甚至導致動物持續(xù)至成年后的神經(jīng)認知功能障礙。在現(xiàn)有全身麻醉藥引發(fā)非成熟動物腦毒性的研究基礎(chǔ)上，本研究將全身麻醉藥用于大腦發(fā)育的更早期——胎兒期，但結(jié)果顯示，異氟烷宮內(nèi)暴露沒有加重胚胎期大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，反而在麻醉早期表現(xiàn)出一定的減緩作用，說明全身麻醉藥的暴露對此階段的非成熟大腦不產(chǎn)生明顯的神經(jīng)退化作用。

結(jié)合全身麻醉藥引起發(fā)育神經(jīng)元凋亡的機制和宮內(nèi)暴露的特殊性，本研究采用1.3%異氟烷宮內(nèi)暴露未產(chǎn)生明顯神經(jīng)退化的原因如下：(1)胎兒期可能未處于全身麻醉藥毒性的易損期內(nèi)。大腦神經(jīng)元表面受體功能的發(fā)育具有階段特異性，研究[5]發(fā)現(xiàn)，異氟烷引起凋亡的發(fā)育神經(jīng)元為谷氨酸能、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能和多巴胺能神經(jīng)元，毒性作用可能是全身麻醉相關(guān)的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體和GABA受體功能由興奮性向抑制性轉(zhuǎn)換不一致引起的。在鼠腦的發(fā)育過程中，出生后7 d鼠腦的NMDA受體才具有極高的敏感性，此時應用全身麻醉藥如異氟烷，會顯著抑制NMDA受體或激活GABA受體，引起內(nèi)外源凋亡途徑的激活，導致過量神經(jīng)元凋亡，故此期被視作是全身麻醉藥發(fā)育神經(jīng)毒性的易損期?，F(xiàn)有的全身麻醉藥發(fā)育神經(jīng)毒性的研究大多選擇于此階段實施。但胎鼠與出生后的幼鼠不同，其腦內(nèi)NMDA受體還沒有發(fā)育，或此階段GABA受體功能尚不能完全發(fā)揮作用，全身麻醉藥或因不能結(jié)合相應的功能性受體而使毒性作用減弱，故胎兒期階段的大腦對全身麻醉藥的神經(jīng)毒性不敏感。(2)異氟烷的發(fā)育神經(jīng)毒性具有劑量(濃度)依賴性，過高濃度和較長持續(xù)時間方可造成大腦神經(jīng)元的損害，如使用3%的異氟烷或大于4 h的干預時間才能明顯增加胎鼠腦神經(jīng)元的凋亡[6-7]，在沒有達到毒性濃度和時間下，異氟烷可以通過降低腦代謝率、減緩能量消耗、減輕細胞鈣超載、抑制興奮性氨基酸釋放及產(chǎn)生抗氧化等作用，表現(xiàn)出一定的神經(jīng)保護作用。(3)宮內(nèi)環(huán)境中母體雌激素、孕激素產(chǎn)生的腦保護作用不容忽視。比如雌激素可調(diào)節(jié)腦血管功能、促發(fā)一氧化氮形成、拮抗興奮性毒性等，孕激素也具有穩(wěn)定神經(jīng)元膜、減輕脂質(zhì)過氧化反應、抑制神經(jīng)元過度興奮等作用，從而產(chǎn)生積極的神經(jīng)保護。與出生后的幼鼠缺乏足夠的雌、孕激素水平相比，胎鼠在宮內(nèi)獲得母體高水平雌、孕激素的腦保護作用，這可能也是避免其發(fā)育神經(jīng)元過度凋亡的原因。

參考文獻

[1]Loepke AW,Soriano SG.An assessment of the effects of general anesthetics on developing brain structure and neurocognitive function[J].Anesth Analg,2008,106(6):1681-1170.

[2]Li Y,Liang G,Wang S,et al.Effects of fetal exposure to isoflurane on postnatal memory and learning in rats[J].Neuropharmacology,2007,53(8):942-950.

[3]Jevtovic-Todorovic V,Hartman RE,Izumi Y,et al.Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits[J].J Neurosci,2003,23(3):876-882.

[4]Stratmann G.Neurotoxicity of anesthetic drugs in the developing brain[J].Anesth Analg,2011,113(5):1170-1179.

[5]Zhou ZW,Shu Y,Li M,et al.The glutaminergic,GABAergic,dopaminergic but not cholinergic neurons are susceptible to anaesthesia-induced cell death in the rat developing brain[J].Neuroscience,2011,74:64-70.

[6]Wang S,Peretich K,Zhao Y,et al.Anesthesia-induced neurodegeneration in fetal rat brains[J].Pediatr Res,2009,66(4):435-440.

[7]Istaphanous GK,Howard J,Nan X,et al.Comparison of the neuroapoptotic properties of equipotent anesthetic concentrations of desflurane,isoflurane,or sevoflurane in neonatal mice[J].Anesthesiology,2011,114(3):578-587.

通訊作者劉志強，E-mail：drliuzhq@hotmail.com

基金項目：上海市科學技術(shù)委員會醫(yī)學引導資助項目(編號：14411966700)；上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會基金面上項目(編號：20124287)