許愛斌，劉建國，張健，李俊峽，和渝斌

? 論著 ?

羥基紅花黃色素A對心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的保護作用

許愛斌，劉建國，張健，李俊峽，和渝斌

目的研究羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）對心肌細(xì)胞模擬缺血/再灌注（simulated ischemia/reperfusion，SI/R）損傷的保護作用。方法采用H9c2心肌細(xì)胞建立SI/R損傷模型，檢測心肌細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶（LDH）水平，TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡，Western blot檢測Akt/ eNOS信號通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果與SI/R組比較，20μM HSYA預(yù)處理能顯著提高SI/R損傷的H9c2細(xì)胞的存活率，（69.7±5.8）% vs. （79.9±5.8）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Control 組相比，SI/R組心肌細(xì)胞LDH釋放增加，（43.3±9.4）U/L vs. （129.5±11.9）U/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與SI/R組相比，HSYA可顯著降低LDH的釋放，而加入PI3K的抑制劑LY29004后，這種作用消失。與Control組比較，SI/R損傷顯著增加H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與SI/R組相比，SI/ R+HSYA組細(xì)胞凋亡率顯著下降，而加入LY29004后，逆轉(zhuǎn)了HSYA的抑制凋亡的作用。與SI/R組相比，SI/R+HSYA組 p-Akt蛋白的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），加入LY29004后 p-Akt 蛋白的表達(dá)被明顯抑制。與SI/R組比較，SI/R+HSYA組 p-eNOS 蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），加入LY29004后 p-eNOS蛋白的表達(dá)被明顯抑制。結(jié)論羥基紅花黃色素A能增強H9c2細(xì)胞活力，減少心肌細(xì)胞損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡，并通過激活A(yù)kt/eNOS信號通路發(fā)揮保護作用。

羥基紅花黃色素A；缺血/再灌注損傷；心肌細(xì)胞；凋亡

心血管疾病是危害人類生命健康的主要疾病之一，目前是工業(yè)國家患者死亡的主要原因[1]。雖然臨床上可以采取支架置入或者冠脈搭橋等方法來復(fù)通堵塞的血管，恢復(fù)血流支配，但缺血區(qū)的損傷反而加重，這種繼發(fā)的心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，M/IR）損傷已經(jīng)成為冠心病治療研究的一個熱點[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)中藥中活血化瘀藥可促進缺血組織血管新生，能減輕M/IR損傷，顯示出其在M/IR損傷防治中的潛在應(yīng)用價值[3,4]。中藥紅花功能主治是活血化瘀，其中紅花黃素是其提取物，羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是其主要藥效成分[5]。本研究利用H9c2心肌細(xì)胞模擬缺血/再灌注（simulated ischemia/reperfusion，SI/R）損傷，旨在探討HSYA對M/IR損傷的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料H9c2細(xì)胞株購于American Type Culture Collection（ATCC，VA，USA）。H S Y A購自中國藥品生物制品檢定所（批號：111637-200905）。DMEM-HG培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS一抗（CST），二抗（sigma），TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），乳酸脫氫酶檢測試劑盒LDH（南京建成生物工程研究所），MTT（sigma），LY29004（sigma）。

1.2 主要儀器超凈工作臺（江蘇蘇凈，SW-CJ-1FB），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），恒溫?fù)u床（上海福瑪，KYS-100C），臺式離心機（長沙湘儀，TDZ5-WS），多功能酶標(biāo)儀（TECAN），倒置顯微鏡（Olympus）。

1.3 SI/R損傷模型建立模型建立參考文獻(xiàn)[6]：H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞長到80%～90%融合時改用無血清的DMEM培養(yǎng)，放置于95%N2/5%CO2的環(huán)境中孵育10h后，更換為含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基繼續(xù)37℃常規(guī)培養(yǎng)2h。

1.4 分組除MTT實驗外，將培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞分為5組。①Control組：加入含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基，置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；②SI/R組：按照1.3項中的造模方法建立SI/R損傷模型；③SI/R+HSYA組：培養(yǎng)基中加入20μM HSYA，24h后建立SI/R損傷模型，其余操作同上；④SI/R+LY29004組：培養(yǎng)基中加入10μM LY29004（PI3K抑制劑），1h后建立SI/R損傷模型，其余同上；⑤SI/R+ HSYA +LY29004組：在SI/R過程前的24h和1h，分別加入20μM HSYA和10μM LY29004，其余操作同上。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 MTT檢測細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，按上述方法建立SI/R損傷模型后，加入20μl的濃度為5 mg/ml的MTT，37℃孵育4h，小心去除上清液，每孔加入500μl的DMSO，充分溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀490 nm處測OD值。細(xì)胞存活率（%）= 處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.5.2 細(xì)胞損傷檢測分別收集各組培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上清，2000 r/min離心20min后取上清，參照試劑盒說明書檢測LDH活力。

1.5.3 TUNEL染色根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，PBS洗后固定，加入0.1%Triton X-100，冰浴孵育2min，加入TUNEL檢測液，37℃孵育60min，封片后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。

1.5.4 western blot檢測H9c2細(xì)胞按前述分組處理后去除培養(yǎng)上清，PBS洗滌1次，加入蛋白裂解液，冰浴孵育20min，收集裂解液，4℃下12000g離心20min，吸取上清液，測定蛋白濃度。各取30 μg蛋白樣品，12% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉后，加一抗4℃孵育過夜，洗膜后，二抗室溫孵育1h，再洗膜后，曝光顯影，Biorad GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)攝像，分析目的條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞存活率MTT法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。與SI/R組比較，20μM HSYA預(yù)處理能顯著提高SI/R損傷的H9c2細(xì)胞的存活率，（69.7±5.8）% vs. （79.9±5.8）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2 LDH活性比較正常情況下，LDH存在于細(xì)胞胞漿中，當(dāng)心肌細(xì)胞損傷時，LDH被釋放到培養(yǎng)上清液中。與Control 組相比，SI/R組LDH釋放增加，（43.3±9.4）U/L vs. （129.5±11.9）U/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與SI/R組相比，HSYA可顯著降低LDH的釋放，而加入PI3K的抑制劑LY29004后，這種作用消失，表明HSYA具有保護心肌細(xì)胞不受損傷的作用，而這種保護可能是通過PI3K這條途徑發(fā)揮作用的（圖2）。

2.3 TUNEL染色TUNEL法通過綠色熒光探針標(biāo)記，特異性檢測細(xì)胞凋亡時產(chǎn)生的斷裂的DNA片段。與Control組比較，SI/R損傷顯著增加H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與SI/R組相比，SI/R+HSYA組細(xì)胞凋亡率顯著下降，而加入LY29004后，逆轉(zhuǎn)了HSYA的抑制凋亡的作用，表明HSYA能夠抑制SI/R誘

導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡，并且是通過激活PI3K通路發(fā)揮作用（圖3）。

2.4 western blot檢測結(jié)果為進一步明確PI3K通路在HSYA保護心肌細(xì)胞中的作用，繼續(xù)檢測了PI3K的下游關(guān)鍵蛋白Akt-eNOS的表達(dá)。western blot檢測結(jié)果表明，與Control組比較，SI/R組p-Akt蛋白表達(dá)略有增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與SI/R組相比，SI/R+HSYA組p-Akt蛋白的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），加入LY29004后p-Akt蛋白的表達(dá)被明顯抑制。與SI/R組比較，SI/R+HSYA組p-eNOS蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），加入LY29004后 p-eNOS蛋白的表達(dá)被明顯抑制（圖4）。

3 討論

心肌缺血缺氧是冠心病的主要發(fā)病機制，而M/IR損傷是指在心肌缺血后恢復(fù)血流反而加重心肌細(xì)胞和組織的損傷[7]，目前中藥在抗M/IR損傷和心肌保護方面具有潛在科研和臨床價值[8]。中藥丹紅注射液雖已廣泛應(yīng)用于臨床，但是其具體作用機制尚不清楚。

本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)模擬M/IR損傷研究紅花有效成分HSYA的作用機制。從細(xì)胞和分子水平來研究藥物對心血管疾病的保護作用及機制，也是目前心血管疾病研究的常規(guī)方法[9]。研究結(jié)果表明HSYA 能夠提高SI/R損傷模型的心肌細(xì)胞活力，減少細(xì)胞死亡，提示具有心肌保護作用。HSYA可顯著降低LDH的釋放，減少細(xì)胞的凋亡，而加入PI3K的抑制劑LY29004后這種保護和抗凋亡作用消失。同時，western blot檢測表明HSYA能夠使SI/R損傷的心肌細(xì)胞中Akt和eNOS磷酸化表達(dá)增加，加入抑制劑后該作用消失，證實HSYA的保護作用是通過激活PI3K-Akt-eNOS這條通路發(fā)揮的。而PI3K-Akt-eNOS是缺血/再灌注損傷補救酶（RISK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成之一，是細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[10,11]。

目前中藥對心血管疾病的治療及心血管保護作用機制是中醫(yī)藥學(xué)研究的熱點，也是中藥長期發(fā)展的一個重要研究領(lǐng)域。本研究發(fā)現(xiàn)，HSYA可明顯提高心肌細(xì)胞的存活率，減少SI/R損傷后的LDH釋放，同時采用RISK通路的抑制劑證實了HSYA對心肌的保護作用可能主要是通過PI3KAkt-eNOS通路發(fā)揮的作用，進一步闡明了其心肌保護作用機制。

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Preventive effect of hydroxysafflor yellow A (HSYA) on cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury

XU Ai-bin*, LIU Jian-guo, ZHANG Jian, LI Jun-Xia, HE Yu-bin.*Department of Cardiovascular Diseases, General Hospital of Chinese PLA Beijing Military Area Command, Beijing 100700, China.

ObjectiveTo study the preventive effect of hydroxysafflor yellow A (HSYA) on simulated cardiomyocyte ischemia-reperfusion (SI/R) injury.MethodsThe model of SI/R injury was established by using H9c2 cardiomyocyte. The survival rate of cardiomyocyte and level of lactate dehydrogenase (LDH) were detected, apoptosis was detected by using TUNEL staining assay, and Akt/eNOS protein expressions were detected by using Western blot test.ResutlsThe survival rate of H9c2 cardiomyocyte with SI/R injury increased significantly in SI/R+HSYA group compared with SI/R group [(69.7±5.8) % vs. (79.9±5.8)%, P＜0.05]. The release of LDH increased in SI/R group compared with control group [(43.3±9.4) U/L vs. (129.5±11.9) U/L, P＜0.05]. HSYA decreased significantly the release of LDH, which disappeared after LY29004 (PI3K inhibitor) added. The apoptosis rate of H9c2 cardiomyocyte increased significantly in SI/R group compared with control group (P＜0.05). The apoptosis rate of H9c2 cardiomyocyte decreased significantly in SI/R+HSYA group compared with SI/R group, which was reversed after LY29004 added. The expression of p-Akt increased significantly in SI/R+HSYA group compared with SI/R group (P＜0.05), which was significantly inhibited after LY29004 added. The expression of p-eNOS increased significantly in SI/R+HSYA group compared with SI/R group (P＜0.05), which was significantly inhibited after LY29004 added.ConclusionHSYA can improve the viability of H9c2 cardiomyocyte, relieve cardiomyocyte injury, inhibit cardiomyocyte apoptosis, and play a protective role through activating Akt/eNOS signal path.

Hydroxysafflor yellow A; Ischemia-reperfusion injury; Cardiomyocyte; Apoptosis

R541.4

A

1674-4055(2015)05-0663-03

2015-04-12）

（責(zé)任編輯：姚雪莉）

100700 北京,北京軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科

許愛斌,E-mail:947931686@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2015.05.24