任宇鵬，宋純，孟慶凱

（遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科，沈陽110042）

Tspan8在結腸癌細胞中的表達及小干擾RNA干擾后對SW620細胞功能的影響

任宇鵬，宋純，孟慶凱

（遼寧省腫瘤醫(yī)院大腸外科，沈陽110042）

目的 檢測Tspan8在結腸癌細胞中的表達，采用siTspan8下調Tspan8的表達，觀察其對SW620細胞轉移、浸潤及增殖功能的影響。方法采用Western blot和實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測4種結腸癌細胞系中Tspan8蛋白和mRNA表達水平，以siTspan8對SW620細胞中Tspan8進行干擾，干擾后采用MTT及Transwell對增殖、轉移及浸潤進行檢測。結果4種結腸癌細胞系中Tspan8在蛋白水平及mRNA水平均有表達，Western blot顯示來自轉移灶的人結腸癌細胞系SW620中Tspa8表達水平高于來自原發(fā)灶的Colo-205、HCT-116及HT-29，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），qRT-PCR顯示SW620中Tspan8mRNA表達高于Colo-205、HCT-116及HT-29，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。MTT及Transwell顯示siTspan8對SW620中Tspan8進行干擾后，結腸癌細胞增殖沒有改變，轉移及浸潤能力減弱。結論Tspan8在結腸癌細胞中有表達，下調Tspan8表達對結腸癌細胞的轉移及浸潤有抑制作用。

結腸癌；Tspan8；小干擾RNA；四跨膜蛋白

結腸癌是發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，呈年輕化及發(fā)病率逐年增高趨勢，轉移及浸潤是結腸癌惡性行為的主要特征之一，首要轉移臟器以肝臟為多，一半患者可能最終出現(xiàn)肝轉移，約25%的結腸癌患者首診時發(fā)現(xiàn)肝轉移。伴有轉移的結腸癌患者生存時間低于1年，因此其轉移特征一直是研究的主要方向［1］。四跨膜蛋白超家族在惡性腫瘤轉移及浸潤中的作用受到研究者關注［2］，Tspan8是研究較深入的四跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）成員，在胃癌、肝癌及食管癌中高表達，與腫瘤轉移及復發(fā)呈正相關［3］。Tspan8可能在腫瘤的預測、診斷、預后評估方面具有重要的臨床意義［4］。

本研究對結腸癌細胞株中Tspan8在蛋白及mRNA水平的表達進行了檢測，并采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術對其表達進行下調，從而進一步研究其在結腸癌細胞增殖、浸潤及轉移中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

結腸癌細胞株Colo-205、HCT-116、SW620及HT-29購自中國中科院上海細胞庫，采用常規(guī)貼壁細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)、傳代及保存。

1.2 實驗試劑

兔多克隆Tspan8抗體及逆轉錄試劑盒購自美國Biorbyt公司，膜蛋白提取試劑盒購自百仕葆北京生物醫(yī)藥科技有限公司，All-in-One qPCR Mix試劑盒購自美國GeneCopoeia公司，Lipofectamine LTX and PLUS購自美國Invitrogen公司。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。siTspan8及siControl均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 Western blot法：按說明書提取結腸癌各細胞株總蛋白，BCA定量試劑盒測定蛋白的濃度，樣品均定量為5 g/L，每條泳道均上樣60 μg蛋白，經12%十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓70 V條件下經80 min電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜，加二抗室溫孵育1.5 h，TBST清洗后ECL發(fā)光，凝膠顯像儀顯像。

1.3.2 實時定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）法：采用RNA分離試劑盒Trizol試劑盒提取純化各細胞株總RNA；所有RNA樣本濃度均稀釋至1 g/L，根據(jù)逆轉錄—擴增試劑盒說明書進行逆轉錄及擴增。RTPCR反應體系（2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，50× Syber Green 2 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL）。反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，40個循環(huán)。所有反應均設立了復孔，并以DEPC水代替模板，cDNA為陰性對照。Tspan8上游引物：5′-CAGTAGCATATGCGTGTCA-3′，下游引物：5′-CCAGCTGGGCTGAGACTA-3′；GAPDH上游引物：5′-GCATCGCCAAGGCTCAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGCAGACGTCAGTCGA-3′。

1.3.3 siTspan8轉染：siTspan8序列為5′-CAACCUA CUUCAAUGTT-3′。將（3.0～8.0）×105細胞接種于6孔板，選擇24 h內細胞融合達到70%～90%的細胞株進行轉染，根據(jù)Lipofectamine LTX and PLUS試劑說明書進行轉染。采用Western blot和qRT-PCR對 siTspan8組和siNegative組中的Tspan8表達進行比較，進行轉染效率的檢測。

1.3.4 細胞增殖檢測：采用MTT檢測細胞增殖，按MTT試劑盒操作，比色選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，重復3次。

1.3.5 細胞遷移能力檢測：按Transwell Polycarbonate Membrane Inserts試劑盒操作步驟進行操作，在顯微鏡下取8個不同視野（×100）進行計數(shù)，重復3次，計算每次遷移細胞減少的百分比。

1.3.6 細胞侵襲能力檢測：按BioCoat Matrigel invasion chamber試劑盒操作步驟進行操作，顯微鏡下取8個不同視野（×100）進行計數(shù)，重復3次，計算侵襲細胞減少百分比。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用PASW Statistics 18.0軟件進行作圖及統(tǒng)計分析，計量資料采用x±s表示，率的比較采用χ2檢驗。Western blot法采用QuantityOne檢測灰度值，與qRT-PCR結果均采用GraphPad Prism 6.0進行單因素方差分析及作圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌細胞株的Western blot檢測結果

在26 kDa處有灰色條帶顯示，Tspan8在4組細胞株中均有表達，來自結腸癌轉移灶的SW620中Tspan8蛋白表達較來自原發(fā)灶的Colo-205、HCT-116及HT-29中高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1A。

2.2 結腸癌細胞株的qRT-PCR檢測

4組細胞株中Tspan8在mRNA水平均有表達，SW620中Tspan8 mRNA表達與Colo-205、HCT-116及HT-29對比，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1B。

2.3 Western blot和qRT-PCR對siTspan8轉染效果的檢測

Western blot顯示siTspan8轉染SW620細胞后，Tspan8表達條帶明顯淡于siControl及siTspan8，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。qRT-PCR顯示siTspan8轉染后，SW620細胞Tspan8 mRNA表達量明顯降低，沉默效率約為55%～66%，沉默效果佳，可進行進一步實驗。

2.4 MTT法檢測細胞增殖

MTT檢測siTspan8干擾后SW620細胞株的增殖能力，通過采集0、24、48、72、120 h時間點的數(shù)據(jù)，siControl、Tspan8與siTspan8比較結果顯示，siTspan8干擾對SW620細胞增殖能力的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.5 siRNA轉染后細胞遷移能力檢測

Transwell顯示，siTspan8轉染細胞與siControl轉染細胞及Tspan8細胞相比，明顯降低SW620細胞的遷移能力（P＜0.05），見圖3A。

2.6 siRNA轉染后細胞侵襲能力檢測

瞬時轉染siTspan8較siControl及Tspan8組明顯降低SW620細胞的侵襲能力（P＜0.05），見圖3B。

3 討論

Western blot結果顯示，在蛋白水平Tspan8在結腸癌細胞株中均有表達，在來自轉移灶的SW620中表達量高于來自原發(fā)灶的細胞株，Tspan8過表達可能與消化系統(tǒng)腫瘤轉移及浸潤的惡性行為相關［5，6］。qRT-PCR檢測顯示，來自轉移灶的人胰腺腺癌細胞系的Tspan8 mRNA表達與來自原發(fā)灶的細胞系相比表達水平也較高，這與Western blot結果一致。有研究顯示，Integrinα3、β1明顯與CD9、CD81、CD151共位，Integrinα6β4與CD151及CO-29大部分共位，形成復合體，對結腸癌細胞運動具有促進作用［7］。Tspan8在肝癌及胃癌中過表達，與腫瘤臨床分期呈正相關，與腫瘤的生存率呈負相關［8］。目前還沒有Tspan8與結腸癌臨床病理的相關性研究。結腸癌患者死亡原因以復發(fā)、肝轉移、腹腔轉移及肺轉移為多，Tspan8可能與這些轉移灶復發(fā)灶的形成密切相關。Herlevsen等［9］研究認為，大鼠D6.1A（Tspan8）與Integrinα6β4結合會增加惡性腫瘤細胞運動性，對肝轉移灶形成有促進作用。轉移可能因D6.1A/ Integrin β4β4形成共位復合體，從黏附支持因子轉為轉移支持因子，增強了腫瘤細胞轉移及浸潤能力。有研究認為，二甲雙胍對結腸癌細胞的惡性行為可能有抑制作用，可能通過作用于細胞膜蛋白實現(xiàn)［10］。

本研究采用siRNA技術對SW620結腸癌細胞中Tspan8進行了成功的轉染下調，干擾效率滿意，干擾后SW620細胞增殖能力沒有改變，轉移及浸潤能力下降。這說明，作為細胞膜蛋白，Tspan8對細胞的增殖能力沒有影響，Tspan8在惡性腫瘤細胞生長、分裂中不起到主要作用，Tspan8下調后結腸癌細胞的轉移及浸潤能力明顯下降，Tspan8可能參與結腸癌細胞的運動，過表達會增加惡性腫瘤細胞的轉移活性，并增加其浸潤能力。

也有研究認為，Tspan8可能啟動腫瘤新生血管形成［11］，并與Notch、c-Met、Rhokinase等信號通路具有相關性［12，13］，但需要進一步實驗證明。本研究提示，Tspan8可以作為膜蛋白標志物，也可用于確定來源于不同細胞的間質干細胞，是干細胞治療的可能策略之一［14］。Tspan8為靶向的siRNA，是治療結腸癌可能策略之一。對于四跨膜蛋白超家族的進一步研究，具有更深遠的意義。

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（編輯 陳 姜）

Expression of Tspan8 in Colon Cancer Cell Lines and Effects of siRNA-mediated Tspan8 Gene Silencing on the Cell Function of SW620

REN Yu-peng，SONG Chun，MENG Qing-kai
（Department of Colorectal Surgery，Liaoning Cancer Hospital and Institute，Shenyang 110042，China）

ObjectiveTo evaluate the expression of Tspan8 in colon cancer cell lines and investigate the effect of siTspan8 on the proliferation，invasion and migration of SW620 cells.MethodsWestern blot and quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）were used to detect the protein and mRNA expression in 4 different colon cancer cell lines.siTspan8 was use to knockdown the expression of Tspan8 in SW620 cell. MTT and Transwell assay were used to detect the proliferation，invasion and migration of siTspan8 interfered SW620 cells.ResultsTspan8 which detected by Western blot and qRT-PCR in all four colon cancer cell lines.Western blot and qRT-PCR showed that Tspan8 expressions were higher in SW620，which derived from metastasis colon cancer，than in Colo-205，HCT-116 and HT-29 cell lines，which derived from primary tumor.MTT and Transwell showed that the proliferation has not been changed，the invasion and migration were inhibited after Tspan8 was inferred with siTspan8.ConclusionTspan8 was expressed in colon cancer cells and downregulation of Tspan8 expression may inhibit the invasion and metastasis of colon cancer cells.

colon cancer；Tspan8；small interfering RNA；tetraspanin

R735.3

A

0258-4646（2015）01-0034-04

遼寧省自然科學基金（2014020102）

任宇鵬（1978-），男，主治醫(yī)師，博士. E-mail：pangheshangmomo@163.com

2014-10-13

網絡出版時間：