張亙，黃燕紅，李靜

（1.撫順礦務(wù)局總醫(yī)院普外科，遼寧撫順113008；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，中國醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，沈陽110001）

磷酸化P53與ERα在乳頭狀甲狀腺癌中的相關(guān)性研究

張亙1，黃燕紅2，李靜2

（1.撫順礦務(wù)局總醫(yī)院普外科，遼寧撫順113008；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，中國醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，沈陽110001）

目的 探討磷酸化P53［p-P53（Ser 6）］與雌激素受體（ER）α在乳頭狀甲狀腺癌（PTC）中的表達(dá)及其相關(guān)性。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)Elivision plus二步法檢測p-P53（Ser 6）、突變P53（mut-p53）、ERα在34例生育期女性乳頭狀甲狀腺癌組織石蠟切片中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析p-P53（Ser 6）與ERα表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果生育期女性的PTC組織中均有p-P53（Ser 6）的的表達(dá)，陽性率為100%，表現(xiàn)為細(xì)胞核或細(xì)胞核/質(zhì)陽性染色，其表達(dá)與mut-P53的檢測結(jié)果有明顯不同。生育期女性PTC組織中p-P53（Ser6）的表達(dá)水平與ERα呈顯著正相關(guān)（r=0.334，P=0.053），而mut-P53的表達(dá)水平與ERα表達(dá)無相關(guān)（r=-0.078，P=0.661）。結(jié)論p-P53（Ser6）與ERα的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示P53磷酸化可能參與促進(jìn)了生育期女性PTC的發(fā)生、發(fā)展。

磷酸化P53；雌激素受體α；乳頭狀甲狀腺癌；免疫組化

乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，起病較隱匿，臨床表現(xiàn)及生物學(xué)特征復(fù)雜多變，且具有較高的局部侵襲性和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PTC在我國的發(fā)病率逐年增加，且主要為青中年女性高發(fā)。近年來的研究表明，P53基因是重要的腫瘤抑制基因，其表達(dá)的蛋白質(zhì)可分為野生型（wild type P53，wt-P53）和突變型（mutant P53，mut-P53）。野生型為腫瘤抑制因子，其突變型可抑制野生型的功能，加速癌癥進(jìn)程，提示P53與多種腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)。前期研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中雌激素受體（estrogen receptor，ER）亞型α的表達(dá)可促進(jìn)PTC的發(fā)生和發(fā)展［1］。本研究擬應(yīng)用免疫組織化學(xué)Elivision?plus二步法檢測磷酸化P53（phosphorylated P53，p-P53）、ERα在34例PTC的表達(dá)，并進(jìn)一步分析p-P53與ERα的相關(guān)性，探討其在PTC發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取我院病理科2007年至2010年臨床資料完整的PTC存檔蠟塊34例（不包括微小癌）。均為生育期女性，年齡（32.62±8.74）歲。PTC患者首診和治療均在我院，病程3年內(nèi)手術(shù)治療。無頸部放射史，無甲狀腺癌家族史。通過查閱我院病案室病志，獲取患者的性別、年齡等相關(guān)臨床資料。

1.2 主要試劑及染色方法

免疫組化染色采取改良的ElivisionTMplus二步法。一抗分別為兔源性抗p-P53（Ser 6）抗體（英國Abcam公司，稀釋度1∶350）、兔源性抗mut-P53抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司，稀釋度1∶350）、鼠源性抗ERα單克隆抗體（丹麥Dako公司，稀釋度1∶200）。ElivisionTMplus試劑盒、DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。

取厚度4 μm的甲醛固定、石蠟包埋組織切片，常規(guī)二甲苯和梯度乙醇脫蠟脫苯，92～98℃枸櫞酸鈉溶液抗原熱修復(fù)，冷卻后去離子水沖洗。3%H2O2室溫孵育10 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗，加入一抗4℃過夜。PBS-Tween 20沖洗后，先后加入ElivisionTMplus試劑盒中的試劑A和試劑B。最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察有無表達(dá)及表達(dá)強弱評分和亞細(xì)胞定位。

1.3 結(jié)果判定

采用Allred score方法［2，3］。具體如下：PS為甲狀腺細(xì)胞的表達(dá)比例（0，不表達(dá)；1，＜1/100；2，1/100～1/10；3，1/10～1/3；4，1/3～2/3；5，＞2/3），IS為甲狀腺細(xì)胞的表達(dá)強度（0，不表達(dá)；1，弱；2，中；3，強），表達(dá)評分TS=PS＋I(xiàn)S，0～2分為不表達(dá)，≥3分為表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。陽性率比較采用χ2檢驗，表達(dá)評分采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗和Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-P53（Ser 6）與mut-P53的陽性率、表達(dá)水平及亞細(xì)胞定位

生育期女性的PTC組織中p-P53（Ser 6）的陽性率為100%，mut-P53的陽性率為70.6%，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。p-P53（Ser 6）與mut-P53的亞細(xì)胞定位表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），而表達(dá)評分比較無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1，圖1。

2.2 生育期女性PTC組織中p-P53（Ser 6）、mut-P53與ERα表達(dá)評分的相關(guān)分析

統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示：生育期女性PTC組織中，p-P53（Ser 6）的表達(dá)水平與ERα呈明顯正相關(guān)（r= 0.334，P=0.053，圖1），尤其是p-P53（Ser6）在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均表達(dá)以及僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)時（r= 0.522，P=0.018），而細(xì)胞核中表達(dá)的p-P53（Ser 6）與ERα的表達(dá)水平無顯著的相關(guān)性（r=0.135，P= 0.646）。而mut-P53的表達(dá)水平與ERα無相關(guān)（r=-0.078，P=0.661，圖1）。

3 討論

P53基因是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因之一，也是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)性最高的基因之一，有“分子警察”之稱。P53基因分為野生型和突變型2種，其產(chǎn)物也有野生型和突變型。正常細(xì)胞內(nèi)的P53基因為野生型，它可以阻止受損的DNA重新復(fù)制，且對細(xì)胞增生有負(fù)調(diào)節(jié)作用，是一種抑癌基因，對維持細(xì)胞的正常生長和抑制細(xì)胞的惡性增殖過程起著重要作用。但P53基因的失活及突變是眾多腫瘤的啟動因素。

P53基因突變是人類惡性腫瘤發(fā)生的最常見基因突變之一，其突變和異常表達(dá)幾乎見于人類所有的腫瘤中，在人類癌癥中發(fā)生突變的頻率可高達(dá)50%以上。P53基因突變后即具有癌基因的作用，可能引起甲狀腺癌變，并使其向低分化甲狀腺癌轉(zhuǎn)化，伴有P53突變的PTC惡性程度常偏高。已有研究證實，mut-P53蛋白的表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)［4，5］。在甲狀腺惡性腫瘤中，P53基因改變主要表現(xiàn)為點突變、缺失和插入，這些基因改變主要位于第5～8號外顯子中，且95%以上為點突變，所形成的mut-P53不但失去了wt-P53的抑癌功能，而且還獲得了一系列類似于癌基因的功能，促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)程。在癌癥發(fā)生過程中，通常是P53的一個等位基因發(fā)生突變，另一個保持wt-P53活性，這時在細(xì)胞內(nèi)同時存在mut-P53和wt-P53 2種蛋白單體，mut-P53抑制wt-P53活性，占據(jù)主導(dǎo)地位。一般來說，P53發(fā)生突變后，會喪失wt -P53所具有的細(xì)胞周期阻滯、介導(dǎo)細(xì)胞衰老、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生等抑癌基因功能，與此同時，mut-P53獲得了一系列類似癌基因特性的功能，如轉(zhuǎn)錄一系列靶基因加速癌癥進(jìn)程、增強癌細(xì)胞化學(xué)耐藥性、阻止癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生等［6］。據(jù)報道，mut-P53在PTC中的表達(dá)可高達(dá)76%，可為甲狀腺癌的分化、診斷及轉(zhuǎn)歸判斷等提供客觀依據(jù)［7～9］。這也與本研究對PTC組織中mut-P53的檢測結(jié)果一致，但是關(guān)于該病變中p-P53的研究至今鮮有報道。

wt-P53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期僅數(shù)分鐘，而mut-P53蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期延長，可被免疫組化方法檢測出來。但已有研究發(fā)現(xiàn)，P53蛋白經(jīng)磷酸化修飾后，其穩(wěn)定性明顯增高，也可被免疫組化方法檢測出來。而且突變型與野生型P53蛋白均可被磷酸化，這種磷酸化進(jìn)一步有助于mut-P53的穩(wěn)定。Melnikova等［10］發(fā)現(xiàn)，雖然過量表達(dá)的鼠雙微染色體2（murine double minute 2，MDM2；人同源蛋白為HDM2）可以降低P53蛋白的含量，但是卻不能降低磷酸化后的mut-P53含量，提示磷酸化不但可以維持這種促進(jìn)細(xì)胞增殖失控的突變蛋白在核中的積累，而且還增強了它的致癌能力。P53可在多部位被磷酸化。Minamoto等［11］比較了腫瘤和正常細(xì)胞中P53的磷酸化修飾位點，發(fā)現(xiàn)并不一致，提示可能因為修飾位點不一樣造成了功能不同。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在N端（ser6/ser9）被Raf/ras/MAPK/ERK1/2信號通路磷酸化的P53是調(diào)節(jié)及整合Raf/ras/MAPK/ ERK1/2介導(dǎo)的促增殖、生長作用與轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor，TGF-β）/Smad介導(dǎo)的抑制細(xì)胞增殖作用的關(guān)鍵節(jié)點［12］。P53這種磷酸化形式與后繼的TGF-β信號Smad轉(zhuǎn)錄因子生理學(xué)上有密切的相關(guān)性，改變基因的表達(dá)程序，導(dǎo)致TGF-β不能發(fā)揮其抑制增殖的作用，可促進(jìn)腫瘤生長［12］。而在PTC中除了抑癌基因P53突變所產(chǎn)生的影響外，還有較為公認(rèn)的癌基因Braf突變［13］。Braf是raf蛋白中最主要的活性形式，突變后的Braf活性持續(xù)增強，使Raf/ras/MAPK/ERK1/2介導(dǎo)的信號通路異?；罨?，除了進(jìn)一步促進(jìn)增殖作用外，還可能進(jìn)一步促進(jìn)磷酸化的P53表達(dá)增多［13］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生育期女性的PTC組織中p-P53（Ser6）表達(dá)的陽性率（100%）顯著高于mut-P53（70.6%），進(jìn)一步提示磷酸化修飾可提高P53穩(wěn)定性，參與促進(jìn)PTC的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，生育期女性PTC患者中p-P53（Ser6）的表達(dá)水平與ER α呈顯著正相關(guān)，尤其p-P53（Ser6）在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)以及僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)時，提示滯留于細(xì)胞質(zhì)中的p-P53可能通過與ERα的相互作用而促進(jìn)PTC的發(fā)生、發(fā)展。在結(jié)直腸癌中的研究已顯示，P53滯留于細(xì)胞質(zhì)中、缺乏核轉(zhuǎn)位的一個重要原因是由于基因突變所致［14］。

綜上所述，p-P53在生育期女性PTC中高度表達(dá)，并與ERα的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，從而可能參與促進(jìn)了PTC的發(fā)生、發(fā)展。因此，在PTC的病理診斷中，mut-P53及p-P53的表達(dá)檢測均可作為臨床輔助診斷、評價甲狀腺癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)，對臨床診治及預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。

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（編輯 王又冬）

Correlation between Phosphorylated P53 Protein and Estrogen Receptor α Expression in Papillary Thyroid Cancer

ZHANGGen1，HUANG Yan-hong2，LI Jing2
（1.Department of General Surgery，the General Hospital of the Mining Bureau ofFushun，F(xiàn)ushun 113008，China；2.Department of Endocrinology and Metabolism，Institute of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between phosphorylated P53 protein and estrogen receptor（ER）α expressions in papillary thyroid cancer（PTC）.MethodsImmunohistochemical staining was performed on thyroid tissue sections to detect phosphorylated P53［p-P53（Ser6）］，mutant P53（mut-P53），ERα protein expressions in the female PTC patients of reproductive age（n=34）by Elivision?plus two-step system.The relationship between p-P53（Ser6）and ERα expressions was further analyzed.ResultsThe expression of p-P53（Ser6）was found in all the samples of PTC lesions from the female patients of reproductive age（n=34），which exhibited either combined nuclear and cytoplasmic staining or exclusively nuclear localization.The expression pattern of p-P53（Ser6）was significantly different from that of mut-P53.In female PTC patients of reproductive age，p-P53（Ser6）expression was positively correlated with that of ERα（r=0.334，P=0.053），while no correlation was found with the mut-P53 expression（r=-0.078，P=0.661）.ConclusionThe correlation between p-P53（Ser6）and ERα expression indicates that the phosphorylation of P53 may play an important role in PTC development in females of reproductive age.

phosphorylated P53；estrogen receptor α；papillary thyroid cancer；immunohistochemistry

R736

A

0258-4646（2015）01-0051-04

遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃（LJQ2011080）；遼寧省科技攻關(guān)層次計劃（JH2）項目（2008225007）

張亙（1967-），男，副主任醫(yī)師，碩士.

李靜，E-mail：lijingendocrine@126.com

2014-10-19

網(wǎng)絡(luò)出版時間：