楊振軍，史昌乾，薛景鳳

（1.承德醫(yī)學院解剖教研室，河北承德067000；2.武警遼寧總隊大連醫(yī)院院長辦公室，遼寧大連116013）

慢性腦缺血大鼠模型中海馬神經(jīng)元凋亡與缺血時間的相關(guān)性

楊振軍1，史昌乾2，薛景鳳1

（1.承德醫(yī)學院解剖教研室，河北承德067000；2.武警遼寧總隊大連醫(yī)院院長辦公室，遼寧大連116013）

目的 探討慢性腦缺血加速大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的作用，初步闡明其機制。方法健康成年雄性SD大鼠90只，隨機分為假手術(shù)組（n=30）和實驗組（n=60），分別于術(shù)后第7、14和21天處死取材，每個時間點隨機選取假手術(shù)組大鼠10只、實驗組大鼠20只。實驗組大鼠采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的方法，建立慢性腦缺血模型；假手術(shù)組頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，不做結(jié)扎。硫堇染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)變化；SP免疫組織化學法觀察海馬神經(jīng)元Bax和Bcl-2蛋白表達的動態(tài)變化；單寧酸-氯化鐵媒染法觀察大鼠海馬微血管構(gòu)筑的動態(tài)變化。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對大鼠海馬神經(jīng)元Bax和Bcl-2蛋白表達、海馬微血管密度（MVD）、微血管面積（MVA）進行定量分析。結(jié)果實驗組大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2蛋白的表達率與假手術(shù)組相比明顯降低（P＜0.05）；且隨缺血時間的延長，Bcl-2蛋白的表達率逐漸下調(diào)，21 d實驗組明顯低于與7 d實驗組（P＜0.05）。實驗組大鼠海馬神經(jīng)元Bax蛋白的表達率與假手術(shù)組相比明顯升高（P＜0.05）；且隨缺血時間的延長，Bax蛋白的表達率逐漸上調(diào)，21 d實驗組明顯高于7 d和14 d實驗組（P＜0.05）。實驗組各時間點大鼠海馬的MVA和MVD均較假手術(shù)組明顯下降（P＜0.05）；隨著造模時間的延長，MVA和MVD逐漸下降，14 d和21 d實驗組的MVA和MVD明顯低于7 d實驗組（均P＜0.05），且21 d實驗組的MVD明顯低于14 d實驗組（P＜0.05）。結(jié)論慢性腦缺血可致海馬MVA、MVD及Bcl-2蛋白的表達進行性下降，Bax蛋白的表達進行性增高，進而導(dǎo)致學習和記憶功能障礙逐漸加重，這可能是血管性癡呆的原因之一。

慢性腦缺血；海馬；Bcl-2；Bax；微血管構(gòu)筑

血管性癡呆在癡呆的發(fā)病中居第二位，隨著人口老齡化及飲食結(jié)構(gòu)的改變，血管性癡呆的發(fā)病呈增長趨勢［1］。慢性腦缺血是導(dǎo)致血管性癡呆的主要原因，血管性癡呆發(fā)病早期以認知功能損害為主要表現(xiàn)，最終可導(dǎo)致持久或進行性的認知與神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙［2］。海馬與學習記憶密切相關(guān)，是大腦近期記憶環(huán)路的主要結(jié)構(gòu)［3］。有研究表明：慢性腦缺血可以導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元功能障礙［4，5］，但關(guān)于慢性腦缺血模型建立后，海馬微血管構(gòu)筑及Bcl-2、Bax蛋白表達率的動態(tài)變化報道較少。本研究采用單寧酸-氯化鐵媒染法觀察慢性腦缺血大鼠模型建立21 d內(nèi)海馬微血管構(gòu)筑及其動態(tài)變化，Bcl-2、Bax蛋白表達率的動態(tài)變化，為探討慢性腦缺血導(dǎo)致記憶障礙的機制及尋找干預(yù)慢性腦缺血引起腦損傷的方法，提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量250～300 g（購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：11400700005419，清潔級大鼠，常規(guī)飼養(yǎng)）。大鼠隨機分為假手術(shù)組（n=30）和實驗組（n=60）。實驗組大鼠采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的方法，建立慢性腦缺血模型［6，7］，假手術(shù)組切開頸部皮膚，分離雙側(cè)頸總動脈，不做結(jié)扎。

1.2 取材及觀察

1.2.1 單寧酸-氯化鐵染色：分別于術(shù)后第7、14和21天處死取材，每個時間點隨機選取假手術(shù)組大鼠5只、實驗組大鼠10只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室至升主動脈插管，200 mL溫生理鹽水（37℃）快速沖洗血管后，用0.1 mol/L磷酸緩沖液、4%多聚甲醛和10%單寧酸的混合媒染固定液250 mL灌流固定，4 h后斷頭取腦［8］。小心剝除顱骨和周圍軟組織后，取出腦組織，截取視交叉平面至大腦橫裂的一段腦組織。Leica振蕩切片機連續(xù)冠狀切片，片厚50 μm，自海馬水平部出現(xiàn)開始，每隔2片取1片，放入2%氯化鐵溶液中顯色，蒸餾水漂洗，裱于涂有APES的載玻片上，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，Olympus光學顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.2 硫堇染色：常規(guī)硫堇染色，Olympus光學顯微鏡下觀察（10×10）并攝片。

1.2.3 免疫組織化學染色：分別于術(shù)后第7、14和21天處死取材，每個時間點隨機各取假手術(shù)組大鼠5只、實驗組大鼠10只。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌流固定，4 h后取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂的一段腦組織，4%多聚甲醛后固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚6 μm。自海馬水平部出現(xiàn)開始，每隔10張取蠟帶貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，用于免疫組織化學染色。

1.3 定量分析

1.3.1 免疫組織化學染色及定量分析：采用SP免疫組織化學染色法觀察海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax蛋白的表達情況。一抗為兔抗，稀釋濃度Bcl-2為1∶50、Bax為1∶100，用PBS代替一抗作為陰性對照，以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒彌漫分布為陽性反應(yīng)。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，Olympus光學顯微鏡下觀察，并攝片。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對免疫組織化學陽性結(jié)果進行定量分析。于海馬CA2區(qū)任取3個視野（10×20），計算陽性產(chǎn)物占視野面積的百分比。每例標本選取5張切片，每張切片選取3個視野，取平均值。

1.3.2 微血管構(gòu)筑定量分析：每例標本于海馬水平部平面分別隨機選取5張單寧酸-氯化鐵染色切片，每張切片在顯微鏡下（10×10）根據(jù)海馬分區(qū)分別在CA1、CA2、CA3及CA4區(qū)各選取1個視野。采用Mi-Vnt圖像分析系統(tǒng)對海馬各區(qū)的微血管密度（microvessel density，MVD）和微血管面積（micorvessel area，MVA）進行定量分析。取海馬CA1、CA2、CA3及CA4區(qū)的MVD平均值作為海馬水平部MVD值；取海馬CA1、CA2、CA3及CA4區(qū)的MVA平均值作為海馬水平部的MVA值。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 硫堇染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠海馬各區(qū)神經(jīng)元排列緊密，神經(jīng)元胞體較大，細胞核大而圓，核仁清晰。實驗組大鼠海馬神經(jīng)元密度降低、排列松散，神經(jīng)元胞體縮小、大小不規(guī)則、細胞周間隙增寬，部分細胞固縮深染，細胞核固縮、部分細胞核仁消失；且隨缺血時間的延長，這種變化逐漸加?。▓D1）。

2.2 海馬神經(jīng)元Bcl-2蛋白表達的動態(tài)變化

Bcl-2蛋白免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色細膩顆粒狀，位于細胞質(zhì)；海馬水平部各區(qū)均可見Bcl-2蛋白的表達，以CA2區(qū)居多。與假手術(shù)組大鼠相比，實驗組大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2蛋白的表達明顯減少（P＜0.05，表1）；且隨缺血時間的延長，Bcl-2蛋白的表達逐漸下調(diào)，其中21 d實驗組明顯低于與7 d實驗組（P＜0.05，圖2）。

2.3 海馬神經(jīng)元Bax蛋白表達的動態(tài)變化

Bax免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色粗顆粒狀，位于細胞質(zhì)，海馬水平部各區(qū)均可見Bax蛋白的表達，以CA2區(qū)居多。與假手術(shù)組大鼠相比，實驗組大鼠海馬神經(jīng)元Bax蛋白的表達明顯增多（P＜0.05，表1）；且隨缺血時間的延長，Bax蛋白的表達逐漸上調(diào)，其中21 d實驗組明顯高于7 d和14 d實驗組（P＜0.05，圖3）。

2.4 海馬微血管的形態(tài)變化

光鏡下觀察，可見假手術(shù)組中進入海馬裂的小動脈首先分出數(shù)支橫行動脈，再由橫行動脈發(fā)出分支，分布于海馬裂兩側(cè)的海馬水平部各區(qū)。在水平部各區(qū)內(nèi)微血管分布密集，相互吻合成網(wǎng)，但與周圍腦組織的血管之間吻合較少（圖4A）。實驗組大鼠海馬水平部微血管顯著減少，分布雜亂，血管之間的吻合較少；并且隨著造模時間的延長，微血管數(shù)量逐漸減少（圖4B、4C）。

定量分析結(jié)果顯示：實驗組各時間點大鼠海馬的MVA和MVD均較假手術(shù)組明顯下降（P＜0.05，表2）。隨著造模時間的延長MVA和MVD逐漸下降，14 d實驗組及21 d實驗組的MVA和MVD明顯低于7 d實驗組（P＜0.05），且21 d實驗組與14 d實驗組相比MVA的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但21 d實驗組的MVD明顯低于14 d實驗組（P＜0.05）。

3 討論

血管性癡呆早期的核心癥狀是記憶功能減退，而海馬是大腦近期記憶環(huán)路（海馬—穹窿—乳頭體—丘腦前核—扣帶回）的主要結(jié)構(gòu)，是學習和記憶功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同時，海馬也是腦缺血時極易受損的一個腦區(qū)，對缺血、缺氧極為敏感。SD大鼠基底動脈環(huán)完整，因此結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈可以有效的減少脈絡(luò)膜動脈和大腦后動脈的血供，降低大鼠腦組織的血流灌注，又可以避免腦組織由于完全缺血導(dǎo)致的損傷。脈絡(luò)膜動脈和大腦后動脈是大鼠海馬主要血供來源，兩者均來源于頸內(nèi)動脈，海馬水平部的營養(yǎng)主要來源于脈絡(luò)膜動脈分支，該動脈由頸內(nèi)動脈腦底段發(fā)出，進入海馬裂后分出數(shù)支橫行動脈，再由橫行動脈發(fā)出分支分布于海馬裂兩側(cè)的海馬水平部各區(qū)［9］。

本研究發(fā)現(xiàn)：海馬水平部各區(qū)內(nèi)毛細血管相互吻合成網(wǎng)，但與周圍腦組織的血管之間吻合較少，海馬區(qū)腦組織很難通過側(cè)支循環(huán)獲得血液供應(yīng)，因此結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈會導(dǎo)致海馬區(qū)腦組織血供出現(xiàn)大幅度的下降。表現(xiàn)為慢性腦缺血實驗組各時間點大鼠海馬的MVA和MVD均較假手術(shù)組明顯下降。并且隨著缺血時間的延長，缺血、缺氧損傷導(dǎo)致海馬微血管內(nèi)微栓塞形成增加、微血管平滑肌收縮、微血管管腔閉塞，微血管功能進一步下降［10，11］，所以隨著造模時間的延長，大鼠海馬的MVA和MVD表現(xiàn)為進行性降低。

Bcl-2是目前公認的抗凋亡基因，可通過抑制細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子釋放、作為氧自由基拮抗劑等多種途徑抑制細胞凋亡［12，13］。Xue等［14］報道Bcl-2蛋白能減少海馬組織缺血后的神經(jīng)元凋亡。Bax為細胞凋亡促進因子，高表達的Bax蛋白可互相結(jié)合形成同源二聚體，誘導(dǎo)和促進細胞凋亡。

本研究顯示，慢性腦缺血模型大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2蛋白的表達明顯降低，Bax蛋白的表達明顯升高，并且這種變化隨缺血時間的延長逐步加劇。結(jié)合其微血管構(gòu)筑的變化考慮：慢性腦缺血時大鼠海馬血流量大幅度下降，缺血、缺氧導(dǎo)致的氧自由基毒性增高、細胞內(nèi)鈣離子超載、谷氨酸的興奮毒性等引起海馬神經(jīng)元凋亡增加。隨著缺血損傷時間的延長，微循環(huán)功能進一步降低，神經(jīng)元的凋亡逐漸增加。

本研究表明，慢性腦缺血大鼠模型建立21 d內(nèi)，缺血性損傷顯著降低海馬微血管功能、增加海馬神經(jīng)元凋亡，且隨缺血時間的延長，這種變化逐漸加劇，進而導(dǎo)致學習和記憶功能障礙逐漸加重。

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（編輯 陳 姜）

Correlation Study between the Time of Chronic Cerebral Ischemia and Hippocampal Neuron Apoptosis in Rats

YANGZhen-jun1，SHIChang-qian2，XUE Jing-feng1
（1.Department of Human Anatomy，Chengde Medical College，Chengde 067000，China；2.President′s Office，Dalian Branch of Liaoning Armed Police Corps Hospital，Dalian 116013，China）

ObjectiveTo investigate the effects of the chronic cerebral ischemia on the rats′hippocampal neurons，and to explore its mechanism.MethodsA total of90 healthy，adult male SD rats were applied in this study and randomly divided into sham operation group（n=30）and experimental group（n=60）.The rats in both groups were respectively sacrificed 7-day，14-day and 21-day after operation，with each time point of 10 from sham operation group and 20 from experimental group.The chronic cerebral ischemia rats model were established by permanently ligating the common carotid arteries on both sides of rats，as experimental group.Sham operation group were established by incise cervical median，only separated common carotid arteries on both sides，not ligated.Thionine staining was used to observe the morphological changes of hippocampus neurons.Immunohistochemistry staining was used to observe dynamic changes of expression of Bcl-2 and Bax in hippocampusneurons，and MiVnt image analytical system to quantitatively analyze the results.TA-FE method was used to detect the dynamic changes of hippocampal microvascualr architecture. MiVnt image analytical system to quantitatively analyze the microvessel density（MVD）and micorvessel area density（MVA）of horizontal part of hippocampus.ResultsCompared with sham operation group at the same time point，the Bcl-2 expression in hippocampus neurons of experimental group were significantly lower（P＜0.05），and with time extension，the Bcl-2 expression gradually decreased.The Bcl-2 expression in 21-day experimental group were significantly lower than 7-day experimental group（P＜0.05）.Compared with sham operation group at the same time point，the Bax expression in hippocampus neurons of experimental group were significantly higher（P＜0.05），and with time extension，the Bax expression gradually increased.The Bax expression in 21-day experimental group were significantly higher than 7-day and 14-day experimental group（P＜0.05）.The MVD and MVA of hippocampus of experimental group at each time point were obviously decreased compared with sham operation group（P＜0.05）.The MVA and MVD gradually decreased with time extension，the MVA and MVD of hippocampus of 21-day and 14-day experimentalgroupsignificantly decreased compared with 7-day experimental group（P＜0.05）.The MVD of hippocampus of21-day experimental group obviously decreased compared with 14-day experimental group（P＜0.05）.ConclusionChronic cerebral ischemia can up-regulate the Bcl-2 expression，decrease the MVD and MVA of hippocampus progressive，increase Bax expression，which may cause learning and memory dysfunction aggravated gradually.This mightbe one reason of vascular dementia.

chronic cerebral ischemia；hippocampus；Bcl-2；Bax；microvascular architecture

R74

A

0258-4646（2015）01-0055-05

河北省科技廳計劃支持項目（13277772D）

：楊振軍（1976-），女，副教授，碩士.

薛景鳳，E-mail：xjf@cdma.edu.com

2014-09-22

網(wǎng)絡(luò)出版時間：