張男，趙茗，孫亞澎

（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科，石家莊050051）

川芎嗪對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響及機(jī)制

張男，趙茗，孫亞澎

（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科，石家莊050051）

目的 探討川芎嗪對(duì)大鼠脊髓損傷（SCI）后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響及可能的機(jī)制。方法健康成年Sprague-Dawley大鼠60只，隨機(jī)分為川芎嗪治療組（TMP組）、單純脊髓損傷組（SCI組）和假手術(shù)組（Sham組），每組20只。Sham組只暴露脊髓，不打擊。SCI組和TMP組采用Allen法損傷大鼠T9脊髓節(jié)段，復(fù)制SCI動(dòng)物模型。造模成功后30 min，TMP組腹腔注射川芎嗪200 mg/kg，每日1次，共7次；SCI組和Sham組腹腔注射等體積的生理鹽水。于術(shù)后1、3、7、14 d隨機(jī)抽取各組動(dòng)物5只，進(jìn)行后肢功能Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評(píng)分、脊髓組織HE染色、脊髓組織中白細(xì)胞介素（IL）17和磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（pSTAT3）表達(dá)水平的檢測(cè)。結(jié)果與Sham組相比，SCI組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分均顯著降低，形態(tài)學(xué)出現(xiàn)典型的SCI改變，脊髓組織中IL-17和pSTAT3表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與SCI組相比，TMP組術(shù)后3、7、14 d BBB評(píng)分均顯著升高，SCI改變減輕，脊髓組織中IL-17和pSTAT3表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論川芎嗪可通過(guò)抑制STAT3活性降低IL-17水平，促進(jìn)SCI大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

脊髓損傷；川芎嗪；大鼠；運(yùn)動(dòng)功能；白細(xì)胞介素17；磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，導(dǎo)致?lián)p傷部位以下運(yùn)動(dòng)和感覺功能障礙［1］。SCI嚴(yán)重的病理后果和高昂的治療費(fèi)用給患者帶來(lái)極大的痛苦，同時(shí)也成為巨大的社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。但是目前尚無(wú)治愈SCI的醫(yī)療措施，因此SCI的修復(fù)和康復(fù)治療研究具有重要的臨床意義。SCI的病理生理學(xué)過(guò)程包括初始的原發(fā)性損傷以及由此引發(fā)的繼發(fā)性損傷。原發(fā)性SCI是脊髓組織遭受外力損傷后瞬間引起的組織損壞，是不可逆性損傷。損傷后在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上因多種因素參與而引發(fā)的脊髓組織進(jìn)行性、自毀性級(jí)聯(lián)放大的破壞過(guò)程稱為繼發(fā)性SCI，其損害程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了原發(fā)性SCI［2］。因此，研究繼發(fā)性SCI的發(fā)生機(jī)制，在預(yù)防和逆轉(zhuǎn)繼發(fā)性SCI以及最大程度地保留殘存的脊髓功能及促進(jìn)損傷脊髓結(jié)構(gòu)和功能重建具有重要意義。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）17是最近新發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)致炎性作用的細(xì)胞因子，主要來(lái)源于CD4+T細(xì)胞亞群中的T輔助細(xì)胞17（T helper 17，Th17）細(xì)胞。而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的異常激活能夠調(diào)控Th17細(xì)胞的分化，促進(jìn)IL-17的分泌［3］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，STAT3及其調(diào)節(jié)的IL-17表達(dá)參與繼發(fā)性SCI的發(fā)生和發(fā)展［4，5］。

川芎嗪具有離子通道阻斷、抗炎、抗氧化、抗凋亡等廣泛的生理藥理學(xué)作用［6，7］。多項(xiàng)研究證實(shí)川芎嗪可促進(jìn)SCI后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)［8～10］，但確切的機(jī)制還不清楚。川芎嗪能否通過(guò)抑制STAT3活性減少IL-17的表達(dá)、促進(jìn)SCI后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)未見報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定TMP處理的SCI大鼠模型脊髓中炎性因子IL-17、pSTAT3表達(dá)水平，觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化及評(píng)價(jià)后肢運(yùn)動(dòng)功能的方法，研究川芎嗪對(duì)SCI后大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)成年健康Sprague-Dawley大鼠60只，雌雄不限，體質(zhì)量（250±20）g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。將60只大鼠隨機(jī)分為川芎嗪治療組（TMP組）、單純脊髓損傷組（SCI組）和假手術(shù)組（Sham組），每組20只。

1.2 主要試劑和儀器

IL-17兔單克隆抗體和pSTAT3兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。全自動(dòng)酶標(biāo)儀和電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Dounce勻漿器購(gòu)自美國(guó)Wheaten公司；-80℃超低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 模型制備

戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，初步定位T9棘突位置。背部正中剃毛，暴露皮膚，常規(guī)消毒鋪無(wú)菌洞巾后，切開大鼠的皮膚，刀柄分離棘突兩側(cè)肌肉，暴露棘突及椎弓板，咬骨鉗咬除棘突及椎板，暴露脊髓，保證硬脊膜完整。參照Allen′s方法制作簡(jiǎn)易打擊模型：由不銹鋼材料制成，擊打棍直徑4.0 mm，打擊頭呈凸形，質(zhì)量20 g，擊打棍套管內(nèi)直徑4.1 mm，打擊高度為2.5 cm，以出現(xiàn)脊髓充血、雙下肢痙攣抖動(dòng)、尾巴痙攣性擺動(dòng)視為造模成功。打擊完畢，逐層縫合肌肉和皮膚。并立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液9 mL/kg以補(bǔ)液。待動(dòng)物清醒后放回飼養(yǎng)籠中單籠飼養(yǎng)。術(shù)后3 d內(nèi)，每天腹腔注射8×104U青霉素鈉以防感染。術(shù)后大鼠可自由飲水、進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境中須保持適宜的溫度和濕度，定時(shí)清潔籠具，并保持大鼠身體干燥，每天擠壓膀胱排尿3次，至大鼠恢復(fù)自主排尿。

1.4 治療方法

TMP組：造模成功后30 min腹腔注射川芎嗪200 mg/kg，此后每天按相同劑量注射1次，共7次。SCI組和Sham組：造模成功后腹腔注射等體積生理鹽水。

1.5 評(píng)定方法

術(shù)后1、3、7、14 d分別從各組隨機(jī)抽取5只大鼠進(jìn)行評(píng)分和相關(guān)測(cè)定。

1.5.1 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評(píng)分：評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：第1步（0～7分）評(píng)判動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)；第2步（8～13分）評(píng)判動(dòng)物后肢的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能；第3步（14～21分）評(píng)估動(dòng)物運(yùn)動(dòng)時(shí)爪子的精細(xì)運(yùn)動(dòng)；3項(xiàng)滿分21分。采用雙盲法，每次評(píng)分由經(jīng)培訓(xùn)后的兩人分別獨(dú)立完成，左右兩側(cè)分別評(píng)分后取平均值作為最后評(píng)分。

1.5.2 HE染色：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每只大鼠隨機(jī)選取2張切片進(jìn)行HE染色，損傷嚴(yán)重段脊髓取視野，光鏡下觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5.3 Western blot：收集脊髓組織并提取蛋白，上樣蛋白30 μg，電泳（10%SDS-PAGE凝膠），轉(zhuǎn)?。?0 V，120 min），5%正常小牛血清封閉，抗pSTAT3（1∶10 000，美國(guó)Abcam公司）、抗IL-17（1∶1 000，美國(guó)Abcam公司）和抗β-actin（1∶1 000，美國(guó)Abcam公司），4℃孵育過(guò)夜，分別與各自對(duì)應(yīng)的二抗（北京中杉）室溫孵育2 h，加ECL顯色劑（北京中杉）1 min，X線膠片曝光成像。結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀（Chemi Image 5500，美國(guó)Alpha Innotech）采集，進(jìn)行灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

Sham組術(shù)后如正常大鼠，SCI組及TMP組大鼠的術(shù)后情況基本一致，打擊后大鼠均表現(xiàn)為身體痙攣性顫動(dòng)，尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng)。麻醉蘇醒后大鼠雙下肢呈弛緩性癱瘓，可出現(xiàn)尿潴留或尿失禁。術(shù)后3 d大鼠開始少量活動(dòng)，進(jìn)食少，尿潴留較嚴(yán)重，部分動(dòng)物伴有血尿及腹部脹氣癥狀。此后飲食及活動(dòng)逐漸增加。大鼠傷口未見感染，身體未出現(xiàn)壓瘡；經(jīng)人工按摩膀胱5～7 d后，所有大鼠基本能夠恢復(fù)自主排尿。

2.2 運(yùn)動(dòng)功能的判定結(jié)果

采用BBB評(píng)分方法對(duì)大鼠SCI后1、3、7及14 d的后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)估，見圖1。Sham組大鼠術(shù)后功能完全恢復(fù)；SCI組和TMP組后肢的運(yùn)動(dòng)功能均有所改善，TMP組改善更顯著，術(shù)后3、7、14 d SCI組和TMP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 脊髓組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

如圖2所示，Sham組神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，白質(zhì)致密，胞膜、核膜清晰，胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，核染色質(zhì)少，呈淡藍(lán)色，核中央有一清楚核仁，胞質(zhì)呈淡紅色。SCI組出現(xiàn)典型的損傷改變，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞增多，神經(jīng)元水腫、變形，空泡形成。TMP組SCI明顯減輕。

2.4 脊髓組織中IL-17和pSTAT3表達(dá)水平的變化

如圖3所示，Sham組IL-17和pSTAT3表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)基本無(wú)變化。SCI組損傷后1、3、7及14 d IL-17和pSTAT3表達(dá)均出現(xiàn)不同程度升高，與Sham組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TMP組術(shù)后3、7、14 d IL-17和pSTAT3表達(dá)均明顯低于SCI組（P＜0.05）。

3 討論

川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一，屬酰胺類生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，有抗腫瘤血管生成、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、抗血小板聚集和抗炎等作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。近來(lái)研究證實(shí)川芎嗪可改善SCI后的神經(jīng)功能的恢復(fù)［8～10］。本研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可顯著提高SCI大鼠BBB評(píng)分，改善SCI后的病理改變，這與以往的報(bào)道一致［8～10］。

損傷后局部免疫炎性反應(yīng)是繼發(fā)性SCI主要機(jī)制［11］。SCI后缺血壞死的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均可產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α、IL-1β、IL-18、IL-10等［12］。它們可刺激其他細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)。這些細(xì)胞因子可作為內(nèi)皮細(xì)胞活化的信號(hào)分子，從而刺激細(xì)胞黏附分子的分泌及白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，這樣將會(huì)誘導(dǎo)白細(xì)胞向損傷區(qū)的浸潤(rùn)，進(jìn)一步加重SCI。

IL-17是最近新發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)效致炎作用的細(xì)胞因子，主要來(lái)源于CD4+T細(xì)胞亞群中的Th17細(xì)胞，與多種感染性疾病、自身免疫性疾病及炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程有著密切的聯(lián)系，近幾年來(lái)成為各個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大量研究證明，IL-17的主要生物學(xué)效應(yīng)是促進(jìn)炎性反應(yīng)，還可以同腫瘤壞死因子α等協(xié)同作用，加大、加強(qiáng)其致炎效應(yīng)［13］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-17還參與中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的增殖、成熟以及趨化過(guò)程［14］。STAT3是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，pSTAT3進(jìn)入核后發(fā)揮重要功能，調(diào)節(jié)大量的基因表達(dá)。近年來(lái)研究報(bào)道，在Th17細(xì)胞分化過(guò)程中，IL-6、IL-21、IL-23及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等多種細(xì)胞因子共同作用下，STAT3轉(zhuǎn)化為pSTAT3并形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，與IL-17啟動(dòng)子直接結(jié)合并且調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，SCI組損傷后1、3、7及14 d IL-17表達(dá)水平均出現(xiàn)不同程度升高，TMP處理后IL-17表達(dá)水平明顯降低。這提示SCI后IL-17大量產(chǎn)生，激活全身炎性反應(yīng)。川芎嗪可抑制IL-17產(chǎn)生，從而減輕SCI后的炎性反應(yīng)。進(jìn)一步檢測(cè)pSTAT3發(fā)現(xiàn)，SCI組損傷后1、3、7及14 d pSTAT3水平均出現(xiàn)不同程度升高，TMP處理后pSTAT3水平明顯降低。提示川芎嗪可能通過(guò)抑制STAT3磷酸化抑制IL-17產(chǎn)生，從而減輕SCI后的炎性反應(yīng)，發(fā)揮促進(jìn)SCI恢復(fù)作用。

本研究結(jié)果證明，川芎嗪對(duì)SCI后動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的促進(jìn)作用與其抑制STAT3磷酸化及IL-17表達(dá)作用有關(guān)，這為川芎嗪在SCI治療的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)，但其促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

［1］張華，白金柱.脊髓損傷后皮質(zhì)脊髓束的相關(guān)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2013，19（4）：349-353.

［2］Baptiste DC，F(xiàn)ehlings MG.Pharmacological approaches to repair the injured spinal cord［J］.J Neurotrauma，2006，23（3-4）：318-334.

［3］Su X，Ye J，Hsueh EC，et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells［J］.J Immunol，2010，184（3）：1630-1641.

［4］宗少暉，曾高峰，方曄，等.大鼠脊髓損傷模型Th17細(xì)胞分化中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3的作用［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2014，35（6）：812-815.

［5］宗少暉，曾高峰，方曄，等.基于STAT3信號(hào)通路研究IL-17在大鼠急性脊髓損傷模型中的作用研究［J］.2014，22（8）：742-745.

［6］納鑫，汪雪蘭，皮榮標(biāo).川芎嗪對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，19（1）：77-80.

［7］趙潤(rùn)英，郝偉，孟祥軍，等.阿魏酸川芎嗪后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41（11）：1018-1021.

［8］嚴(yán)根福，王健，賈玉柱，等.川芎嗪對(duì)急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡的影響［J］.浙江中醫(yī)雜志，2012，47（9）：666-668.

［9］王健，賈玉柱，鄭純威，等.川芎嗪對(duì)急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡和Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（2）：2662-2668.

［10］Hu JZ，Huang JH，Xiao ZM，et al.Tetramethylpyrazine accelerates the function recovery of traumatic spinal cord in rat model by attenuating inflammation［J］.J Neurol Sci，2013，324（1-2）：94-99.

［11］Schwartz M，Lazarov-Spiegler O，Rapalino O，et al.Potential repair of rat spinal cord injuries using stimulated homologous macrophages［J］.Neurosurgery，1999，44（5）：1041-1045.

［12］Popovich PG，Wei P，Stokes BT.Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats［J］.J Comp Neurol，1997，377（3）：443-464.

［13］McAllister F，Henry A，Kreindler JL，et al.Role of IL-17A，IL-17F，and the IL-17 receptor in regulating growth-related oncogene-alpha and granulocyte colony stimulating factor in bronchial epithelium：implications for airway inflammation in cystic fibrosis［J］.J Immunol，2005，175（1）：404-412.

［14］Steinman L.A brief history of T（H）17，the first major revision in the T（H）1/T（H）2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage［J］.Nat Med，2007，13（2）：139-145.

［15］Kortylewski M，Xin H，Kujawski M，et al.Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment［J］.Cancer Cell，2009，15（2）：114-123.

（編輯 陳 姜）

Effect and Mechanism of Tetramethylpyrazine on Motor Function after Spinal Cord Injury in Rats

ZHANG Nan，ZHAO Ming，SUN Ya-peng
（Department of Spine Surgery，The Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveTo observe the effect and mechanism of tetramethylpyrazine（TMP）on motor function after spinal cord injury（SCI）in rats.MethodsTotally 60 healthy adult Sprague-Dawley rats were divided randomly into TMP group，Sham group and SCI group with 20 rats in each group.The Sham group was only exposed spinal cord without imposing any harm.SCI group and TMP group were treated with Allen′s mode at the level of the 9th thoracic vertebra to imitate spinal cord injured animal models.30 min after SCI model was made，TMP group was given 200 mg/kg TMP daily for 7 times by intraperitoneal injection，while SCI group and Sham group were given an equal volume of normal saline daily.On the 1st，3rd，7th and 14th days after SCI，5 rats were selected randomly from each group.The motor function was assessed by Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）scale.The pathological changes of spinal cord tissue were determined by HE staining.The interleukin 17（IL-17）and phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3（pSTAT3）expression were determined by Western blot.ResultsCompared to Sham group，the BBB scores in SCI group were significantly increased，HE staining presented typical pathological changes of spinal cord injury in SCI group，meanwhile the expression of IL-17 and pSTAT3 in the spinal cord tissue in SCI group were all significantly increased（P＜0.05）.Compared to SCI group，BBB scores in TMP group were significantly increased on the 3rd，7th and 14th days after SCI，the pathological changes of spinal cord injury in TMP group was alleviated on the 3rd，7th and 14th days after SCI，the expression of IL-17 and pSTAT3 in TMP group were reduced on the 3rd，7th and 14th days（P＜0.05）.ConclusionTMP may reduce the expression of IL-17 by inhibiting the activity of STAT3 and promote the recovery of the motor function in rats after SCI.

spinal cord injury；tetramethylpyrazine；rats；motor function；interleukin 17；phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3

R651.2

A

0258-4646（2015）01-0060-04

張男（1983-），男，主治醫(yī)師，博士. E-mail：William.nan@163.com

2014-10-12

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：