安娜 孫琳

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性病變中的表達變化

安娜 孫琳

目的 探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)在β淀粉蛋白(amyloid β，Aβ)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性病變中的變化。方法 SD大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，經(jīng)過不同濃度(10、15、20 μmol/L)Aβ25-35毒性片段處理后，通過定量PCR技術(shù)檢測BMP4 mRNA表達水平。SD大鼠雙側(cè)基底前腦注射Aβ1-40建立大鼠癡呆模型，通過免疫組化及免疫印跡檢測基底前腦及海馬區(qū)BMP4蛋白表達水平。結(jié)果 Aβ25-35處理組海馬神經(jīng)元內(nèi)BMP4 mRNA表達較空白對照組明顯減少(P<0.05)。免疫組化和免疫印跡實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，Aβ1-40注射組大鼠基底前腦區(qū)BMP4蛋白表達減少，海馬區(qū)其表達升高(P<0.05)。結(jié)論 Aβ直接下調(diào)神經(jīng)元內(nèi)BMP4轉(zhuǎn)錄及表達，不同腦區(qū)內(nèi)BMP4蛋白可能存在負反饋調(diào)節(jié)作用。

阿爾茨海默??；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類；淀粉樣β蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種進展性神經(jīng)變性疾病，在老年期癡呆中發(fā)病率最高[1]。AD主要病理特征為β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)形成老年斑沉積和異常細胞骨架形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)[2]。Aβ具有強神經(jīng)毒性，在導(dǎo)致大量神經(jīng)元變性和壞死之前可先引起神經(jīng)突觸損傷，進而可引起認知功能障礙[3]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic proteins 4，BMP4)是β轉(zhuǎn)化生長因子超級家族中的一員，依據(jù)序列種類被分為Decapentaplegic(dpp)亞群[4]。BMP最初是作為軟骨內(nèi)骨形成的誘導(dǎo)劑和骨代謝的調(diào)節(jié)劑，廣泛應(yīng)用于開放性脛骨骨折、骨不聯(lián)合及脊柱融合術(shù)的治療。近年發(fā)現(xiàn)，其在成熟期神經(jīng)系統(tǒng)中具有保護作用[5-6]，而BMP在AD病變中的變化及可能作用仍缺乏明確結(jié)論。本研究利用原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元和癡呆大鼠模型探討B(tài)MP4在Aβ毒性病變中的表達變化以及潛在的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 采用Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠16只，體質(zhì)量200～220 g。購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于中國科學(xué)院藥物研究所實驗動物中心(清潔級環(huán)境)，動物的使用符合上海市動物管理委員會管理條例。將SD大鼠隨機分為Aβ注射組和空白對照組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠膽堿能神經(jīng)元損傷模型：大鼠以10% (質(zhì)量濃度)水合氯醛麻醉，固定于BAS立體定向儀上，將齒棒定為-2.4 mm。前囟后1.4～1.6 mm，旁開2.5 mm，鉆顱緩慢進針深度7 mm，Aβ注射組采用1 μL的微量注射器和微量推進器在雙側(cè)基底前腦Meynert核各注射10 μg/μL Aβ1-40(Sigma公司)1 μL，注射時間10 min，注射完畢后，針停留5 min，緩慢拔出，然后用同樣的方法再注射另一側(cè)[7-8]。對照組采用等劑量的PBS溶液注射。手術(shù)后第11天開始進行水迷宮實驗訓(xùn)練，經(jīng)過5 d水迷宮訓(xùn)練后，采集入水后尋找到平臺的時間。水迷宮實驗后取大鼠海馬和基底前腦腦組織。

1.2.2 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)：取孕15～17 d的SD大鼠(購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心)，無菌條件下取胎鼠海馬，0.125%(質(zhì)量濃度)胰蛋白酶消化，加入10%(體積分數(shù))胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打組織20次，收集細胞懸液，接種在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱，24 h后換不含血清的培養(yǎng)液(1% 谷氨酸鹽+2% B27+97% Neurobasal)(Gibco公司)，48 h后加阿糖胞苷，作用24 h后全量換液，此后每3 d半量換液。當神經(jīng)元純度達到80%～90%后用于后續(xù)實驗。

1.2.3 提取與擴增BMP4 mRNA：將Aβ25-35(Sigma公司)溶解于0.1%(質(zhì)量濃度)三氟乙酸溶液中，配成1 mmol/L儲存液，臨用前置于37 ℃孵箱中孵育3 d進行老化處理，使可溶性Aβ聚集成不溶性Aβ[9]。將培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元隨機分為4組，分別用不同濃度Aβ25-35處理海馬神經(jīng)元，使Aβ25-35終濃度分別為10、15、20 μmol/L；另設(shè)立陰性對照，添加等量三氟乙酸溶液。孵育24 h后用總RNA提取(TRIzol)法提取總RNA。實驗步驟嚴格按Realtime PCR試劑盒說明書進行(Takara公司)[9]。用Bio-Rad定量PCR儀(Bio-Rad公司)設(shè)置預(yù)變性95℃ 10 s，PCR反應(yīng)95℃ 5 s，依據(jù)相應(yīng)的退火溫度持續(xù)30 s，循環(huán)40次。BMP4和β-actin cDNA基因全長由Pubmed Genebank查得，委托上海生物工程公司代為設(shè)計并合成。PCR擴增引物如下：BMP4：上游：5′-CGTTACCTCAAGGGAGTGG-3′，下游：5′-GCGACGGCAGTTCTTATTC-3′；β-actin：上游：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′，下游：5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′。

BMP4片段長度為158 kp，退火溫度56℃；β-actin片段長度241 kp，退火溫度60℃。PCR產(chǎn)物含量依據(jù)2-△△Ct計算。每個實驗獨立重復(fù)3次，取均數(shù)。

1.2.4 免疫印跡分析：將凍存的腦組織研磨，制備勻漿。采用Bradford法檢測蛋白濃度，細胞蛋白提取物在SDS-PAGE凝膠上進行電泳，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，麗春紅及考馬斯亮藍染色。聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜浸入5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉的TBST室溫封閉。一抗為兔抗大鼠BMP4(1∶500)或β-actin抗體(1∶2000，Abcam公司)，二抗為HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶500，碧云天公司)，通過電化學(xué)發(fā)光(electro-chemical luminescence，ECL)試劑盒發(fā)光顯影。采用Bio-Rad2000型凝膠成像系統(tǒng)將光片在白光下掃描后，應(yīng)用Quantity One軟件(Bio-Rad公司)進行灰度掃描分析。各組BMP相對水平以BMP條帶灰度值與各自β-actin灰度掃描值的比值表示，并設(shè)空白對照組(對照組)BMP相對蛋白水平為1，計算Aβ處理組BMP相對蛋白水平相對于空白對照組的比值。每個實驗獨立重復(fù)3次，結(jié)果取均數(shù)。

1.2.5 免疫組化：大鼠腦組織免疫組化實驗依據(jù)SP試劑盒說明書(Santa Cruz公司)步驟操作。石蠟切片(10 μm)常規(guī)脫蠟，30%(體積分數(shù))H2O2室溫下持續(xù)孵育切片10 min，以滅活內(nèi)源性酶，之后切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫下持續(xù)孵育30 min。滴加稀釋好的一抗(兔抗大鼠BMP4抗體1∶500)(Abcam公司)，4℃過夜。滴加生物素化山羊抗兔二抗(1∶500)(碧云天公司)，37℃ 20 min后PBS沖洗，DAB顯色。圍繞藍色細胞核的細胞質(zhì)呈明確棕色染色者即為BMP4陽性細胞。選取同一染色條件下的6～7張切片，每張切片隨機取100個細胞，將圖像攝入計算機，使用IMS圖像分析系統(tǒng)(Nikon公司)設(shè)定基礎(chǔ)統(tǒng)計面積，分別調(diào)定背景、陰性細胞、陽性細胞，通過計算機自動分析，得出陽性表達面積及陽性強度均值，按下列公式計算BMP4表達陽性指數(shù)：陽性指數(shù)=陽性表達面積×陽性強度均值。陽性指數(shù)越高表示目標蛋白表達越高。每個實驗獨立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用GraphPad Phrism 5軟件進行分析，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗，兩組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同Aβ濃度組原代海馬神經(jīng)元BMP4基因轉(zhuǎn)錄水平 10、15、20 μmol/L Aβ處理組以及對照組原代海馬神經(jīng)元BMP4基因含量分別為0.483±0.035、0.280±0.139、0.100±0.006、1.000±0.098，4組間BMP4表達含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=60.52，P<0.05)。與對照組比較，不同Aβ濃度組海馬神經(jīng)元BMP4基因含量均降低(P<0.05)，且20 μmol/L Aβ處理組原代海馬神經(jīng)元BMP4基因含量較10 μmol/L Aβ處理組低(P<0.05)。

2.2 各組大鼠不同腦區(qū)BMP4蛋白表達

2.2.1 免疫印跡實驗：與對照組相比，Aβ1-40注射組大鼠基底前腦區(qū)BMP4蛋白表達降低(P<0.05)，而海馬區(qū)則較對照組高(P<0.05)。結(jié)果見圖1、表1。

圖1 大鼠不同腦區(qū)BMP4蛋白含量比較(免疫印跡法)

圖2 各組大鼠不同腦區(qū)BMP4陽性細胞表達(箭頭所示)比較(免疫組化×200)

2.2.2 免疫組化實驗：結(jié)果見表1、圖2。與對照組相比，Aβ1-40注射組基底前腦區(qū)內(nèi)BMP4陽性細胞減少(P<0.05)，而海馬區(qū)則呈現(xiàn)反向變化(P<0.05)。

3 討論

AD是以漸進性的學(xué)習(xí)、記憶、行為和人格障礙為主要臨床特征的神經(jīng)精神疾病，Aβ在腦內(nèi)的沉積是最典型的病理特征，Aβ具有神經(jīng)毒性，通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激、代謝壓力和興奮性毒性誘導(dǎo)神經(jīng)元損害[10]。BMP在神經(jīng)發(fā)育期具有誘導(dǎo)細胞分化及增殖等作用[11]，近來研究結(jié)果顯示，BMP在成熟神經(jīng)系統(tǒng)中具有神經(jīng)修復(fù)作用，并參與記憶學(xué)習(xí)過程。Fischer等[12]研究發(fā)現(xiàn)，BMP4可以對抗N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性，對神經(jīng)元具有保護作用。Sun等[13]研究發(fā)現(xiàn)，BMPs內(nèi)源性抑制劑Chordin敲除鼠腦內(nèi)BMP增多，其短期記憶和學(xué)習(xí)能力明顯增強，提示BMP與學(xué)習(xí)記憶具有一定關(guān)聯(lián)。作者研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)，BMP6/7蛋白在Aβ毒性病變中含量發(fā)生變化，不同腦區(qū)變化不同[9]；AD的發(fā)病機制與Aβ沉積于神經(jīng)突觸，誘導(dǎo)樹突內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)紊亂有關(guān)，而BMP的下游信號LIM激酶1(LIM kinase 1，LIMK1)通過cofilin蛋白調(diào)節(jié)肌動蛋白(actin)的解離與聚合，從而影響樹突內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)的形態(tài)[14]。與BMP6/7分屬不同亞群的BMP4蛋白是否具有相同變化，以及BMP在AD發(fā)病中的潛在作用和意義需要進一步研究。

本研究選擇10、15和20 μmol/L濃度的Aβ25-35處理培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元，24 h后通過Real time PCR方法檢測BMP4 mRNA含量，結(jié)果顯示Aβ25-35直接處理海馬神經(jīng)元可導(dǎo)致BMP4的基因轉(zhuǎn)錄減少。作者前期研究應(yīng)用水迷宮試驗證實Aβ1-40注射組大鼠具有記憶認知功能障礙[9]。本研究采用Aβ1-40注入大鼠雙側(cè)基底前腦建立膽堿能神經(jīng)元損傷模型，利用免疫組化和免疫印跡方法檢測基底前腦和海馬區(qū)BMP4蛋白的表達情況，結(jié)果顯示在基底前腦區(qū)，Aβ1-40可對基底前腦區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生直接神經(jīng)毒性，導(dǎo)致BMP4表達降低，這與Aβ25-35直接作用于原代海馬神經(jīng)元導(dǎo)致BMP4 mRNA含量降低的實驗結(jié)果相一致，提示Aβ可直接引起B(yǎng)MP4轉(zhuǎn)錄和表達降低。而海馬區(qū)BMP4蛋白表達則升高，提示BMP4可能參與Aβ毒性病變，并在不同腦區(qū)有不同表達。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要特征之一是各腦區(qū)之間存在雙向聯(lián)系，而基底前腦和海馬區(qū)之間正是具有雙向投射纖維[15]。基底前腦膽堿能系統(tǒng)主要包括腹側(cè)紋狀體、杏仁核、Meyner核、隔核及斜方體，隔核海馬膽堿能投射纖維終止于海馬區(qū)所有類型的神經(jīng)元[16]。同時，海馬區(qū)神經(jīng)纖維元投射到隔核的外側(cè)和內(nèi)側(cè)區(qū)，反饋海馬區(qū)的信息[17]。隔核海馬投射纖維的完整性對于海馬同步化、記憶獲取十分必要[18]。另外，基底前腦和海馬區(qū)的雙向遞質(zhì)傳遞對于海馬反饋和信息糾正也十分重要。在本研究中，Aβ1-40注射到基底前腦區(qū)的大鼠模型，其海馬區(qū)BMP4含量升高，故推測海馬區(qū)BMP4上調(diào)是源于基底前腦區(qū)BMP4下調(diào)的負反饋。基底前腦區(qū)神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞受到Aβ1-40的神經(jīng)毒性作用，該區(qū)域神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞受損嚴重，一方面直接導(dǎo)致神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞內(nèi)合成具有營養(yǎng)及保護作用的BMP4的功能下降，另一方面Aβ1-40可能通過其他拮抗蛋白降低BMP4的表達，其機制有待深入探討。因本研究中Aβ注射區(qū)為基底前腦，故海馬區(qū)未直接受到Aβ毒性攻擊，較之基底前腦去相比，受毒性攻擊的程度和時間上都會削弱，由于腦區(qū)間的雙向投射系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，海馬區(qū)BMP4因負反饋而代償性增多。通過海馬區(qū)與基底前腦區(qū)的投射纖維環(huán)路，最終向受損區(qū)提供營養(yǎng)和保護支持。而基底前腦區(qū)與海馬區(qū)的確切投射機制目前仍不明，有待于進一步研究。

本實驗通過在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上證實Aβ可誘導(dǎo)BMP4的轉(zhuǎn)錄和表達下調(diào)，提示BMP4可能參與AD病變，同時基底前腦和海馬區(qū)的BMP4可能存在負反饋的自我調(diào)節(jié)功能，這為研究AD發(fā)病機制提供了一種潛在的思路。

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(本文編輯：時秋寬)

Research about the change of bone morphogenetic protein 4 expression in Aβ-induced neurotoxicity

ANNa,SUNLin*.

*DepartmentofGeriatricPsychiatry,ShanghaiMentalHealthCenter,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200030,China

SUN Lin, Email: xiaosuan2004@126.com

Objective To investigate the change of bone morphogenetic protein 4 (BMP4) expression in amyloid β(Aβ)-induced neurotoxicity. Methods Hippocampal neurons were treated with different concentrations of Aβ25-35 (10，15，20 μmol/L) for 24 h. The mRNA level of BMP4 in rat hippocampal neurons after Aβ25-35 treatment was assayed through realtime PCR.Invivo, Aβ1-40 was bilaterally injected into basal forebrain to simulate neuropathological processes of AD, and the levels of BMP4 protein were tested in the regions of basalforebrain and hippocampus. Results Results of realtime PCR showed that the levels of BMP4 mRNA in Aβ groups were significantly decreased compared with the control group. Immunohistochemisty and western blot results showed that BMP4 protein was significantly decreased in the Aβ group relative to the control group in basalforbrain, while there was an opposite change in hippocampus. Conclusions Aβ directly down-regulates BMP4 expression, and there may be anegative feedback regulation of BMP4 in different brain regions.

Alzheimer’s disease; bone morphogenetic proteins; amyloid beta-protein

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.002

國家自然科學(xué)基金資助項目(81301139)；上海市自然科學(xué)基金資助項目(13ZR1435900)：上海市精神衛(wèi)生中心飛翔計劃(2014-FX-04)

200030 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心老年科

孫琳，Email: xiaosuan2004@126.com

R749.1

A

1006-2963 (2015)04-0233-05

2014-12-02)