黎海瀾 焦 偉 莫柱寧 朱春麗 陽子驥

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院輸血科，南寧市 530021，E-mail:46549668@qq．com)

母嬰血型不合新生兒溶血病(hemolytic disease of newborn，HDN)可導(dǎo)致新生兒黃疸、貧血、水腫、肝脾腫大，甚至膽紅素腦病。因此，采用敏感而且準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)對(duì)HDN早期、準(zhǔn)確的診斷有重要的意義［1－4］。直接抗球蛋白試驗(yàn)、抗體游離試驗(yàn)和抗體放散試驗(yàn)被稱為檢測(cè)HDN的“三項(xiàng)試驗(yàn)”，是早期檢測(cè)HDN的經(jīng)典方法。放散試驗(yàn)在三項(xiàng)中最為敏感，是確診HDN的實(shí)驗(yàn)［5］。放散方法有多種，目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室多采用傳統(tǒng)的熱放散法或酸放散法。本研究分別用酸放散和熱放散法檢測(cè)HDN患兒紅細(xì)胞致敏抗體，以評(píng)價(jià)兩種方法在HDN實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用效果。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 臨床資料 選擇2012年1月至2014年5月我院收治355例疑似HDN的患兒及其母親血標(biāo)本，其中男性患兒172例，女性患兒183例，年齡2 h至13 d，≤5 d 341例，＞5 d 14例，臨床主要表現(xiàn)為貧血和黃疸。隨機(jī)選取同期在本院住院的70例母嬰血型相同或相合、直接抗球蛋白試驗(yàn)及抗體篩查陰性的高膽紅素血癥患兒血樣本做研究對(duì)照，其中男34例，女36例;年齡9 h至11 d;合并新生兒窒息13例、母乳缺乏12例、感染9例、出生后體重明顯下降5例、胎糞排出延遲7例、頭顱血腫6例、低血糖2例、胎膜早破8例、宮內(nèi)窘迫8例。

1．2 試劑 標(biāo)準(zhǔn)抗-A(B)血清、IgM 抗-D、E、C、c、e及抗人球蛋白試劑、篩選細(xì)胞、譜細(xì)胞等均來自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司。ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自制，酸放散試劑盒購自長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限公司，DiaMed低離子/抗人球蛋白卡、DiaMed專用離心機(jī)、DiaMed專用卡孵育系統(tǒng)等均由珠海保瑞達(dá)公司提供。其他儀器還有KA-2200型離心機(jī)(日本久保田研究所)，恒溫水浴箱等。試劑均在有效期內(nèi)使用。

1．3 方法 采母親、HDN患兒靜脈血(必要時(shí)臍帶血)，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。母親血樣本用于血型鑒定及抗體檢測(cè)?；純貉獦?biāo)本經(jīng)3 400 r/min離心2 min，分離血漿及壓積紅細(xì)胞。壓積紅細(xì)胞用生理鹽水充分洗滌3次，留取末次洗液作對(duì)照。取壓積紅細(xì)胞10 μl配成2%、1%紅細(xì)胞鹽水懸液備用。在2支試管中分別加入洗滌好的壓積紅細(xì)胞各1 ml，待同時(shí)做熱放散、酸放散試驗(yàn)。

1．3．1 血型鑒定、血清抗體檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)方案:參照文獻(xiàn)［6］，鑒定患兒及母親ABO及Rh血型，根據(jù)母嬰ABO血型相合與否，按以下程序檢測(cè):三項(xiàng)試驗(yàn);母親血清抗體檢測(cè)等。

1．3．2 熱放散法:依照文獻(xiàn)［6］。在 1 體積(≥1 ml)的壓積紅細(xì)胞中加入等容量的生理鹽水，混勻，置56℃水浴箱中孵育10 min，期間輕搖幾次。取出后置預(yù)先準(zhǔn)備盛有56℃熱水的離心套管內(nèi)，立刻以3 400 r/min離心2 min，取上清液(放散液)做相應(yīng)檢測(cè)。

1．3．3 酸放散法:嚴(yán)格依照廠商的試劑盒說明書進(jìn)行酸放散。酸放散液配制:將放散液A與放散液B按體積比4∶1比例混合均勻(必須現(xiàn)配現(xiàn)用)。將1 ml洗滌好的待檢壓積紅細(xì)胞與1 ml配制好的酸放散液混合均勻，室溫孵育1 min后，以3 400 r/min離心1 min(勿超時(shí))，取上清放散液與中和液按500μl∶80 μl比例混勻，再以3 400 r/min離心2 min，取出上清液(此上清液中含有從紅細(xì)胞表面解離的抗體)做相應(yīng)的檢測(cè)。

1．3．4 檢測(cè)放散液中 IgG抗-A(B)、抗-Rh抗體:用微柱凝膠法分別檢測(cè)2種放散液中的抗-A(B)、抗-Rh抗體，選取98例檢出抗體的放散液進(jìn)行倍比稀釋后加相應(yīng)試劑紅細(xì)胞，測(cè)定抗體效價(jià)并按凝集強(qiáng)度4+(12分)、3+(10分)、2+(8分)、1+(5分)、±(2分)、0(0分)計(jì)算評(píng)分［7］。在低離子/抗球蛋白卡中加入1%相應(yīng)試劑紅細(xì)胞各 50 μl后，各加上述放散液 50 μl，37℃孵育15 min，置卡式專用離心機(jī)離心10 min，按產(chǎn)品說明書判讀結(jié)果。

1．4 母嬰血型不合新生兒溶血病診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］(1)母子血型不合;(2)抗體釋放試驗(yàn)或直接抗球蛋白試驗(yàn)陽性;(3)發(fā)生高膽紅素血癥。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 13．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料分布不符合正態(tài)性，故用中位數(shù)表達(dá)，采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用秩和檢驗(yàn)，以P ＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組檢測(cè)結(jié)果 355例疑似母嬰血型不合HDN患兒中，確診為 HDN 277例，其中 ABO-HDN 275例，Rh-HDN 2例。275例ABO-HDN患兒樣本中，酸放散試驗(yàn)均檢出與患兒血型抗原所對(duì)應(yīng)的抗體，無假陽性。熱放散試驗(yàn)檢出的陽性病例，酸放散試驗(yàn)均檢出陽性。其中有6例ABO-HDN患兒采用酸放散試驗(yàn)結(jié)果陽性(2+～4+)，而熱放散試驗(yàn)結(jié)果陰性，但加入放散液量成倍增加(≥100 μl)時(shí)結(jié)果均陽性(±～1+)。隨即取患兒用于其他檢測(cè)的血樣本，并確保用于熱放散的壓積紅細(xì)胞≥1 ml，嚴(yán)格按文獻(xiàn)操作規(guī)程重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果與原來一致。2例Rh-HDN患兒用酸放散法、熱放散法檢測(cè)均陽性。放散液的回收量和外觀比較:等體積的致敏紅細(xì)胞，酸放散法獲得的放散液外觀呈淺紅色透明、清晰，量多于熱放散法;熱放散法所得放散液呈櫻紅色半透明。酸放散試驗(yàn)耗時(shí)約35 min，熱放散試驗(yàn)則為45 min。

70例高膽紅素血癥患兒血樣本(其中母嬰均為O型30例、A型15例、B型15例，母親為AB型10例)同時(shí)用酸放散法與熱放散法進(jìn)行抗體釋放試驗(yàn)，結(jié)果均陰性。

2．2 兩種檢測(cè)方法檢出的抗體效價(jià)及其評(píng)分比較 酸放散法放散液中IgG抗-A(B)、抗-Rh抗體效價(jià)及評(píng)分均高于熱放散法(u=6．280，P＜0．001)。酸放散法與熱放散法所得紅細(xì)胞放散液中抗體評(píng)分分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。98例母嬰血型不合HDN兩種放散液中抗體效價(jià)及評(píng)分分布、熱放散法與酸放散法對(duì)HDN患兒紅細(xì)胞致敏抗體的放散效果比較，分別見表1、表2。

表1 98例母嬰血型不合HDN兩種放散液中抗體效價(jià)分布(n，%)

表2 98例HDN患兒熱放散法與酸放散法放散液中抗體效價(jià)評(píng)分［中位數(shù)(四分位間距)］

3 討論

本研究結(jié)果顯示，酸放散法效果優(yōu)于傳統(tǒng)熱放散法，酸放散法的抗體放出效率高于熱放散法(P＜0．05)。酸放散法放散液中IgG抗-A(B)、抗-Rh抗體效價(jià)評(píng)分均高于熱放散法(P＜0．05)，酸放散液抗體效價(jià)為4、8、16、32者比例明顯高于熱放散液。在受檢的98例HDN患兒熱放散液中，93例(94．9%)抗體效價(jià)≤4，5例(5．1%)抗體效價(jià)為8;而酸放散液中65例(66．3%)抗體效價(jià)≤4，20 例(20．4%)抗體效價(jià)為 8，11 例(11．2%)抗體效價(jià)為16，2例(2．0%)抗體效價(jià)為32。筆者在實(shí)驗(yàn)中選取部分標(biāo)本做了熱放散后充分洗滌3次，然后將其用酸放散法進(jìn)行重復(fù)放散試驗(yàn)，仍可檢出致敏的抗體。6例ABO-HDN患兒采用酸放散試驗(yàn)結(jié)果陽性，而熱放散試驗(yàn)結(jié)果陰性，但加入放散液量成倍增加(≥100 μl)時(shí)出現(xiàn)弱陽性結(jié)果，說明對(duì)等體積致敏紅細(xì)胞進(jìn)行放散時(shí)，酸放散法所得放散液抗體濃度明顯高于熱放散法。據(jù)之推測(cè):對(duì)受檢標(biāo)本量較少(如壓積紅細(xì)胞＜1 ml)的病例，用酸放散試驗(yàn)應(yīng)比傳統(tǒng)熱放散試驗(yàn)更有優(yōu)勢(shì)。筆者發(fā)現(xiàn)熱放散試驗(yàn)時(shí)，放散液要全部用于相應(yīng)反應(yīng)體系中(放散液應(yīng)≥100 μl)，并及時(shí)檢測(cè)，這不僅使抗體檢測(cè)的方法學(xué)選擇受到限制，而且實(shí)驗(yàn)室不在反應(yīng)體系(如微柱凝膠法)中調(diào)整放散液的加入劑量，就有可能得到假陰性結(jié)果，會(huì)延誤HDN患兒的診治。這提示:對(duì)HDN的血清學(xué)檢測(cè)，采用不同的紅細(xì)胞致敏抗體放散方法及對(duì)放散液中抗體檢測(cè)方法的正確選擇影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，對(duì)于HDN的實(shí)驗(yàn)室診斷，酸放散試驗(yàn)與傳統(tǒng)熱放散試驗(yàn)定性檢測(cè)結(jié)果無差異，但酸放散試驗(yàn)放散效能較優(yōu)，人為干擾因素少，耗時(shí)短，試驗(yàn)條件技術(shù)要求難度低，是一種更可靠、便捷的HDN診斷方法。

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