韓鳳麗，于銘權(quán)

基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）能夠分解血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）基膜基質(zhì)，將SMC 從基膜中釋放出來，從而引起VSMC 的移行，在動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生和發(fā)展過程中起著十分重要的作用［1］。對AS 來說，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及血脂代謝異常是其發(fā)生的重要始動因素。本實(shí)驗(yàn)通過喂飼高脂飼料的方法，建立兔AS模型，應(yīng)用癲狂夢醒湯進(jìn)行干預(yù)治療，觀察其對動脈內(nèi)膜厚度、MMP－9表達(dá)的影響，以期為癲狂夢醒湯抗AS提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料 健康日本大耳白兔32只，均為雄性，體重（2～2.5）kg（遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供）。高脂飼料：1%膽固醇，8%熟豬油和91%的普通飼料。

1.2 藥物、試劑、儀器 癲狂夢醒湯方劑由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬一院中藥局提供。兔抗人MMP－9多克隆抗體（上海太陽生物有限公司），膽固醇粉（安徽科寶生物工程有限公司）。CIAS－1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（北京大恒圖像視覺有限公司）、LEICA－RM－2135石蠟切片機(jī)（德國）。

1.3 方法

1.3.1 藥物（癲狂夢醒湯方）制作 原方藥物：桃仁24g，柴胡9g，香附6g，木通9g，赤芍9g，半夏6g，腹皮9g，青皮6g，陳皮9g，桑皮9g，蘇子12g，甘草15g。在藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室浸泡、煎煮、去渣，每付中藥濃縮至100mL，濃度為1.2g／mL（含生藥量）。根據(jù)人體－家兔體表面積比值法換算家兔的每日用藥量［2］：低劑量組3.1mL／（kg·d）相當(dāng)于含生藥量3.8g／（kg·d），高 劑量組4.7mL／（kg·d）相當(dāng)于含生藥量5.7 g／（kg·d）。中藥高劑量為臨床上每日1劑中藥為標(biāo)準(zhǔn)，中藥低劑量為臨床上每1.5 日一劑中藥為標(biāo)準(zhǔn)。4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分組

1.3.2.1 試驗(yàn)分組 日本大耳白兔單籠飼養(yǎng)，室溫20℃～22℃，相對濕度為50%～60%，自由飲食水。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)：遵循隨機(jī)原則，將動物分成4組（A 空白對照組、B 模型組、C 癲狂夢醒湯低劑量組、D 癲狂夢醒湯高劑量組），每組8只。

1.3.2.2 模型制作［3］實(shí)驗(yàn)開始后，空白對照組繼續(xù)喂飼普通飼料140（g·d）只＋蒸餾水5 ml／kg灌胃；模型組開始喂飼高脂飼料140g／d＋蒸餾水5 ml／kg灌胃；低劑量癲狂夢醒湯組喂飼高脂飼料140g／d＋癲方3.1mL／（kg·d）＋蒸餾水1.9mL／kg灌胃；高劑量癲狂夢醒湯組喂飼高脂飼料140g／d＋癲方4.7mL／（kg·d）＋蒸餾水0.3 mL／kg灌胃；自由飲水，喂養(yǎng)至第12周末。

1.3.3 標(biāo)本留取 實(shí)驗(yàn)動物于第12周末采用頸動脈割傷法處死。迅速剖開腹腔，分離腹主動脈，剝除外膜結(jié)締組織及脂肪，取1cm 動脈血管，沖凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色及免疫組化檢測。

1.3.4 病理形態(tài)學(xué) 將兔主動脈標(biāo)本于4%中性甲醛溶液固定24h之后，自來水沖洗4h～6h，逐級脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊，用石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片厚度5μm，于45℃溫水中展片，分別用普通玻片和多聚賴氨酸防脫玻片，撈片后置于56℃溫箱中干燥2h～3h，用于HE 染色及免疫組化染色。每一標(biāo)本取3張切片（普通玻片）作HE 染色；每一標(biāo)本取3張切片（防脫玻片）作免疫組化染色，均按試劑盒步驟進(jìn)行操作，免疫組化以細(xì)胞漿染色為主，測定其平均灰度值。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，4組間比較采用單因素方差分析（ANVOA），組間兩兩比較用LSD（方差齊）或DunnettT3（方差不齊）法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組內(nèi)膜厚度測定 光鏡下測定，正常組內(nèi)膜厚度5.03μm±0.80μm，模型組269.07μm±37.42 μm，中藥低劑量組72.10μm±6.39μm，中藥高劑量組43.50μm±5.39μm。癲狂夢醒湯組內(nèi)膜厚度明顯低于模型組（P＜0.01）；高劑量癲狂夢醒湯組內(nèi)膜厚度低于低劑量癲狂夢醒湯組（P＜0.05）。

2.2 對MMP－9蛋白表達(dá)的影響 免疫組化示：棕色反應(yīng)物位于胞漿。正常對照組血管壁表達(dá)的少；模型組表達(dá)明顯增多，內(nèi)膜靠近中膜處尤甚，呈棕黃色或棕褐色，融合成片，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，癲狂夢醒湯組表達(dá)明顯減輕（P＜0.01）；與低劑量癲狂夢醒湯組比較，高劑量癲狂夢醒湯組表達(dá)降低（P＜0.01）。灰度值；正常組13.32±3.85，模型組74.58±6.78，中藥低劑量組45.74±6.51，中藥高劑量組33.52±3.64。

3 討 論

中醫(yī)并沒有AS一詞，中醫(yī)將AS形成的首要因素高脂血癥等歸屬為痰濁，將血液的高凝狀態(tài)、血管壁受損、脂斑形成等視為血瘀。由于臟腑功能失調(diào)，氣、血、津液運(yùn)行、代謝障礙，導(dǎo)致痰濁內(nèi)生，無形之痰濁留而不去，致血行不暢，瘀血阻滯，痰瘀交阻，這種病理狀態(tài)持續(xù)發(fā)展下去，痰借血體，血借痰凝，痰瘀互結(jié)，著于血脈，血脈上凝著痰瘀結(jié)塊使脈管本身受損，局部氣血的運(yùn)行和溫煦受阻，日久膠結(jié)不解，凝之愈堅，這種痰濁瘀血相凝之結(jié)塊即是AS斑塊［4］。近年來在大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究中，眾多醫(yī)家采用活血化痰中藥防治AS，均取得了良好的治療效果，也進(jìn)一步證實(shí)了痰瘀互結(jié)是AS的主要病理機(jī)制。痰瘀互結(jié)是AS的基本病機(jī)，那么選用化痰降濁、活血化瘀法則是治療AS的關(guān)鍵之所在［5］。因此，選擇名方癲狂夢醒湯進(jìn)行研究。方中桃仁、赤芍活血化瘀；柴胡、香附、青皮、陳皮、半夏理氣化痰；蘇子、桑皮、腹皮降氣化痰；木通通利血脈；甘草調(diào)和諸藥。諸藥相合共奏豁痰化瘀利竅之功。

MMP 是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，可為SMC從中 膜 遷 移 至 內(nèi) 膜 掃 清 道 路［6］。其 中MMP－9 是MMP家族中的重要成員，主要功能是降解Ⅳ型膠原和彈力纖維，在基質(zhì)降解、VSMC 遷移、AS 形成以及促進(jìn)斑塊破裂上起重要作用［7］。另外有研究表明，MMP－9可通過激活肝素酶參與SMC 從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換的過程［8］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組MMP－9蛋白表達(dá)較正常對照組顯著增高，內(nèi)膜靠近中膜處尤甚，呈棕黃色或棕褐色，融合成片，主動脈內(nèi)膜明顯增厚，提示在AS 中MMP－9蛋白表達(dá)顯著增高；與模型組比較，癲狂夢醒湯可呈劑量依賴性的降低MMP－9表達(dá)水平，減輕動脈內(nèi)膜增厚，提示癲狂夢醒湯可能通過抑制SMC從中膜向內(nèi)膜下遷移，進(jìn)而抑制AS形成。此結(jié)果與以往研究的系統(tǒng)給予MMP－9抑制劑［9］，早期可抑制AS形成的結(jié)果相同。

癲狂夢醒湯能夠通過降低MMP－9的蛋白表達(dá)，減輕主動脈內(nèi)膜增厚，而起到防治AS的作用。表明癲狂夢醒湯抗AS療效可靠，為臨床應(yīng)用癲狂夢醒湯防止AS提供理論依據(jù)。然而AS的病理機(jī)制是多方面的，癲狂夢醒湯是否也可以通過其他途徑和環(huán)節(jié)來達(dá)到防治AS的作用，尚有待于進(jìn)一步研究。

［1］ Newby AC，Zaltsman AB.Molecular mechanisms in intimal hyperplasia［J］.Pathol，2000，190（3）：300－309.

［2］ 譚德福.中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)科實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：206.

［3］ 王鳳榮，劉彤，鄭嫻，等.大柴胡湯對高脂飲食所致兔動脈粥樣硬化的保護(hù)作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007，5（1）：36－38.

［4］ 王東生，袁肇凱，余亞明.痰瘀與動脈粥樣硬化相關(guān)性探討［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，27（3）：162－164.

［5］ 張衛(wèi)萍，任建勛，袁祖貽，等.痰瘀同治法對動脈粥樣硬化家兔凝血／纖溶活性平衡的影響［J］.中醫(yī)雜志，2008，49（4）：349－352.

［6］ Galis ZS，Khatri JJ.Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis the good，the bad，and the ugly［J］.Circ Res，2002，90（3）：251－262.

［7］ Cho A，Reidy MA.Matrix metalloproteinase 9is necessary for the regulation of smooth muscle cell replication and migration after arterial injury［J］.Circ Res，2002，91（9）：845－851.

［8］ Fitigerald M，Hayward IP，Thomas AC，et al.Matrix metalloproteinase can facilitate the heparanase induced promotion of phenotype change in vascular smooth muscle cells［J］.Atherosclerosis，1999，145：97－106.

［9］ 林梅瑟，陳碧新，趙志光，等.姜黃素對動脈粥樣硬化兔基質(zhì)金屬蛋白酶9的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2007，15（3）：189－192.