■劉延國 李 杰 張 琳 栗 敏 王盼盼

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，黑龍江哈爾濱 150030）

白腐真菌能夠分解木質(zhì)素和秸稈纖維吸引人們進(jìn)行廣泛的研究。張輝等[1]采用白腐真菌處理玉米和油菜秸稈，結(jié)果表明在發(fā)酵培養(yǎng)20 d時，油菜秸稈的木質(zhì)素降解率達(dá)到58.07%；在發(fā)酵35 d時，玉米秸稈的木質(zhì)素降解率達(dá)到33.62%。劉朝貴等[2]采用側(cè)耳菌（平菇）處理稻草秸稈，木質(zhì)纖維成分比處理前降低11.94%～14.7%。韋麗敏等[3]利用多種菌處理秸稈，結(jié)果顯示黃孢原毛平革菌和側(cè)耳菌的木質(zhì)素降解率均為27%左右，但前者纖維素的降解率為42%，而側(cè)耳菌纖維素降解率僅有18%。降低秸稈中木質(zhì)素含量，而保留纖維素是處理秸稈的目標(biāo)。以上研究結(jié)果表明平菇生長速度較快，可利用多種木質(zhì)纖維物質(zhì)生長，且要求的生存條件較低，是目前處理秸稈飼料的主要菌種之一。雖然平菇生長較快，但至少也需要20 d[4]，所以提高菌種的生長速度和抗逆性是提高秸稈飼料營養(yǎng)價值的關(guān)鍵。紫外誘變（UV）是最簡單和常用的提高菌種生長速度和產(chǎn)酶量的真菌育種技術(shù)。王謙等[5]用紫外線照射糙皮側(cè)耳的原生質(zhì)體篩選出高效分解秸稈的菌株08P217，處理秸稈后木質(zhì)素和纖維素的降解率均提高0.7倍以上。為此，在北方氣候條件下，以生長速度較快的側(cè)耳菌為出發(fā)菌株，采用紫外誘變技術(shù)，培育生長速度較快和產(chǎn)酶量較高的菌株，以提高處理秸稈的效率，為采用白腐真菌處理秸稈飼料提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及試劑

菌種：試驗所用平菇購于黑龍江省微生物研究所，經(jīng)過本實驗室篩選獲得優(yōu)良菌種P2。

平板與斜面培養(yǎng)基（PDA）：20%土豆汁、2%的葡萄糖、2%瓊脂，pH值自然。

初篩平板培養(yǎng)基：1%麥芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母膏、0.2%蛋白胨、0.05%MgSO4·7H2O、0.4%KH2PO4、2%瓊脂、0.5 mmol/l愈創(chuàng)木酚。

秸稈粉試管培養(yǎng)基：粉碎玉米秸稈87%(其纖維組成見表1)、小麥麩8%、石灰5%、料水比1∶2、121 ℃滅菌30 min，pH值自然。

表1 玉米秸稈粉培養(yǎng)基纖維組成（%）

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化與保存

將保存的菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)接活化2～3次，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 孢子懸液的制備

用鐘罩法收集孢子于無菌蒸餾水中，適當(dāng)稀釋，血球板法計數(shù)，使孢子濃度為1×108個/ml，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 紫外線誘變劑

經(jīng)過試驗確定紫外照射孢子的致死率為70%～80%時為最佳誘變劑量[6]，將所儲備的孢子連續(xù)誘變10批，照射后在紅光燈下適當(dāng)稀釋，分別涂布于PDA培養(yǎng)基中，無處理的孢子液作對照，置于25℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。挑選出優(yōu)先萌發(fā)且長勢良好的菌株接入斜面培養(yǎng)基。

1.2.4 初選

①通過菌絲生長情況的比較，在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩，從中選出長速快于對照菌株、長勢好、菌絲粗壯潔白的菌株與親本進(jìn)行拮抗試驗，挑選拮抗程度較大的菌株。

②用打孔器將等量誘變菌株菌塊接種于初篩平板培養(yǎng)基上，從中挑選變色圈大的菌株，以出發(fā)菌為對照。結(jié)合生長和產(chǎn)酶兩個因素，表現(xiàn)突出的誘變菌株進(jìn)入復(fù)選。

1.2.5 復(fù)選

1.2.5.1 PDA試管菌株長速的比較

將篩出的菌株在培養(yǎng)基上傳代3次，取等量菌塊接種于斜面PDA試管，以出發(fā)菌為對照，每株菌5個重復(fù)，25℃下恒溫避光培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)長齊后劃線，以游標(biāo)卡尺（精確度0.02 mm）測量各菌菌絲的生長速度。

1.2.5.2 酶活性及纖維降解率比較

將篩選出的菌種按試驗分組接種到秸稈粉試管，以出發(fā)菌為對照，每株菌5個重復(fù)，在25℃恒溫避光培養(yǎng)，菌絲20 d都長滿秸稈粉試管，于此時進(jìn)行相關(guān)的測定。參照鞏競的方法[7]，取復(fù)篩菌株試管秸稈粉各4 g，打碎，混勻，加雙蒸水 40 ml，置于4℃冰箱中浸提過夜；次日，用4層紗布過濾離心，取上清即得粗酶液，4℃低溫保藏。其殘渣65℃下烘至恒重用于粗纖維成分的測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

致死率(%)=[對照菌數(shù)量(cfu)-處理后菌數(shù)量(cfu)]/對照菌數(shù)量（cfu）×100；

菌絲生長速度（mm/d）=菌絲長度（mm）/菌絲生長時間（d）。

木質(zhì)素過氧化酶（LiP）酶活的測定：采用亞甲基藍(lán)法；漆酶（Lac）酶活的測定：采用鄰聯(lián)甲苯胺法；纖維素酶酶活的測定：采用DNS法[7]。

發(fā)酵秸稈纖維成分的測定：采用ANKOM220 Fiber Analyzer儀器，按照Van Soest分析法，分析中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、半纖維素（HCEL）、纖維素（CEL）和木質(zhì)素（ADL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 17.0軟件中的One-Way ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's法進(jìn)行各組間多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 紫外誘變劑量的確定(見圖1、圖2)

圖1 P2紫外誘變孢子致死率

圖2 P2紫外誘變30 s萌發(fā)菌株

如圖1、圖2所示，隨著照射時間的延長，孢子的萌發(fā)數(shù)降低，在0～30 s內(nèi)致死率快速升高，在處理30 s時致死率達(dá)78.07%，30 s后上升緩慢，確定以30 s為最佳誘變劑量。

2.2 誘變菌株初選

以30 s為誘變劑量，連續(xù)誘變10批，挑出萌發(fā)菌株194株，其中26株為正突變，正突變率為13.4%，結(jié)合親本對峙試驗（見圖3）和初篩平板培養(yǎng)基篩選試驗（見表2），篩選出直徑較大的5株優(yōu)良誘變菌株，分別為16、18、20、89、102號，其變色圈為出發(fā)菌變色圈直徑的1.5倍以上。

圖3 誘變菌株與親本對峙試驗

表2 誘變菌種愈創(chuàng)木酚變色圈直徑（cm）

2.3 誘變菌株復(fù)選

2.3.1 生長速度

誘變菌株的菌絲生長情況見表3。如表3所示，各誘變菌株生長速度均顯著快于出發(fā)菌，各個菌株生長速度89＞20＞102＞18＞16＞對照組，其中89、20、102、18號誘變菌株的生長速度極顯著地高于對照組(P＜0.01)，而16號誘變菌株生長速度顯著高于對照組(P＜0.05)。

表3 誘變菌株的菌絲生長情況（mm/d）

2.3.2 酶活性（見表4）

表4 誘變菌株胞外酶活性（U/ml）

如表4所示，與出發(fā)菌株對照組相比，誘變菌株木質(zhì)素過氧化酶（LiP）和漆酶（Lac）活性均不同程度地高于對照組，纖維素酶差異不顯著，其中誘變菌株89的酶活性最高，極顯著高于對照組（P＜0.01），誘變菌株89、20和102號的LiP酶活性分別為對照組2.03、1.69倍和1.60倍，誘變菌株89、102、18號的Lac酶活性分別為對照組1.89、1.79倍和1.76倍。

2.3.3 纖維成分變化（見表5）

表5 誘變菌株處理秸稈纖維成分變化（%）

如表5所示，各誘變菌株均不同程度降低了部分纖維成分的含量。其中89號菌株纖維含量降低程度最大，20號菌株次之。與對照相比，89號和20號菌株NDF含量分別降低5.28%和3.77%，達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。二者的ADF含量分別降低5.16%（P＜0.01）和4.58%（P＜0.05）。而木質(zhì)素含量分別降低了19.89%（P＜0.05）和15.37%（P＞0.05）。按木質(zhì)素降解率計算，89號菌株木質(zhì)素降解率較對照組提高了51.76%。

3 討論

3.1 紫外誘變及初篩

紫外誘變處理側(cè)耳菌，方法簡便，是真菌最常用的育種方法之一[8]。研究表明，適當(dāng)劑量的紫外線處理能引起DNA的斷裂和交聯(lián)，核酸和蛋白質(zhì)的交聯(lián)，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用，形成胸腺嘧啶二聚體。紫外誘變時誘變劑的劑量與燈的功率、照射時間和燈與微生物的距離相關(guān)[9]。在本試驗中，采用紫外燈照射30 s，照射孢子懸浮液濃度為1×108個/ml左右，致死率為70%～80%。試驗結(jié)果表明，誘變時間越長，正突變越高，同時負(fù)突變率也較高。因此，30 s的紫外照射進(jìn)行誘變處理有利于提高正誘變率[10]。根據(jù)出發(fā)菌的生長特性，本研究采用孢子進(jìn)行誘變，可避免菌落不純的現(xiàn)象[11]。George等[12]認(rèn)為，能在以愈創(chuàng)木酚為指示劑的培養(yǎng)基上產(chǎn)生變色圈表明微生物具有木質(zhì)素降解能力，且變色圈的大小深淺與產(chǎn)酶能力有關(guān)。本試驗采用了以愈創(chuàng)木酚為唯一碳源的方式，進(jìn)行木質(zhì)素降解能力的篩選，誘變菌株和出發(fā)菌有明顯的拮抗帶，表明誘變后為新菌株，且愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基的變色圈明顯增大，表明誘變菌株木質(zhì)素降解酶代謝能力提高。

3.2 酶活性及纖維降解能力

本試驗結(jié)果表明，通過紫外誘變獲得一枚菌株89號，其LiP和Lac活性分別為出發(fā)菌的2.03倍和1.89倍，菌絲生長速度提高18.21%，LiP、Lac酶活性高峰出現(xiàn)在處理秸稈的第15～20 d。本試驗中纖維素酶活性高峰出現(xiàn)的相對滯后，這正是處理秸稈作為飼料所希望的，分解木質(zhì)素，而保留纖維素作為家畜的營養(yǎng)。張杰[13]采用射線處理白腐真菌，其中處理效果好的菌株其LiP及Lac活性提高1.4～2倍，而且酶活高峰出現(xiàn)在12～18 d，這與本試驗結(jié)果接近。莢榮等[14]對白腐真菌F4孢子懸液進(jìn)行紫外和N+離子注入誘變，獲得菌株漆酶活性是出發(fā)菌株的16倍。陳敏等[15]對刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngiiGIM 5.280）的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外和60Coγ雙重誘變，獲得一株漆酶的高產(chǎn)菌株，與出發(fā)菌相比酶活表達(dá)量提高54.3%。這些試驗結(jié)果均表明紫外誘變可以導(dǎo)致菌株產(chǎn)生分解木質(zhì)素的酶活性顯著提高。由秸稈粉木質(zhì)降解程度可知，木質(zhì)素降解能力與木質(zhì)素過氧化酶（LiP）及漆酶（Lac）酶活性密切相關(guān)。研究表明，LiP催化氧化β-1非酚型木質(zhì)素模型化合物為其芳香正離子自由基，使木質(zhì)素斷裂形成3,4-二甲氧基苯乙醇自由基和質(zhì)子化形式的藜蘆醛，并進(jìn)一步將醛氧化成酸[16]，再經(jīng)過LiP對低分子木質(zhì)素和單環(huán)芳香化合物的開環(huán)作用，獲得的低分子產(chǎn)物可被微生物降解[17]。

王謙等[5]用紫外線照射糙皮側(cè)耳的原生質(zhì)體篩選高效分解秸稈的菌株，采用該菌株處理秸稈其木質(zhì)素和纖維素的降解率分別為出發(fā)菌株的1.75倍和1.71倍。張杰[13]采用射線照射白腐真菌處理秸稈，在發(fā)酵20～30 d時，出發(fā)菌株與誘變菌株發(fā)酵秸稈，其酸不溶木質(zhì)素（ADL）的降解明顯提高；在發(fā)酵的第30 d，其中的3個誘變菌株處理秸稈使ADL的降解率提高0.88～1.23倍。邱愛蓮等[18]采用He-Ne激光對白腐真菌L1原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，選育出一菌株Lx，其木質(zhì)素降解率比出發(fā)菌株提高50%。本試驗結(jié)果表明，誘變菌株89號處理秸稈后其木質(zhì)素含量降低了19.89%，NDF和ADF含量分別降低5.28%和5.16%，木質(zhì)素降解率較對照組提高了51.76%。其它4株誘變菌株的木質(zhì)素、NDF和ADF含量變化較小。本結(jié)果還表明，不同菌株處理的秸稈纖維含量大小與酶活性高低變化相對應(yīng)。秸稈的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，而木質(zhì)素與半纖維素以其堅固的酯鍵相結(jié)合，并將纖維素包裹在其中。木質(zhì)素的分解意味著堅固的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，這樣就可以釋放動物可以消化利用的纖維素，提高秸稈營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。以上研究結(jié)果表明，在秸稈發(fā)酵的15～20 d，木質(zhì)素分解酶的活性遠(yuǎn)高于纖維素酶活性，木質(zhì)素的降解率也大于纖維素的分解率（由表1及表5計算可知），這有利于降解木質(zhì)素而保留纖維素的秸稈處理模式。

4 結(jié)論

通過紫外誘變育種和篩選試驗，綜合生長速度、產(chǎn)酶活性及木質(zhì)素降解能力得到的P89誘變菌株，木質(zhì)素過氧化酶和漆酶活性分別為出發(fā)菌的2.03倍和1.89倍，菌絲生長速度提高18.21%，木質(zhì)素含量降低19.89%。菌株P(guān)89為本研究誘變篩選獲得的開發(fā)秸稈資源優(yōu)秀菌株。農(nóng)業(yè)科學(xué),2011，39（8）：4598-4599.