■楊繼業(yè) 郭曉軍 郭 威 呂紀(jì)濤 袁洪水 朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000）

我國(guó)農(nóng)作物秸稈資源豐富，年產(chǎn)量高達(dá)6.4億噸[1]，它們主要用作飼料、肥料、工業(yè)原料等[2]。目前，玉米秸稈青貯技術(shù)在我國(guó)北方地區(qū)得到廣泛的應(yīng)用和推廣[3]。青貯主要是利用秸稈表面的乳酸菌在厭氧的條件下，將秸稈飼料中的可溶性糖類物質(zhì)降解成乳酸、乙酸等，降低青貯飼料pH值，抑制青貯飼料中腐敗微生物的活動(dòng)，從而保持秸稈中的營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)可以增加飼料適口度、提高消化率[4-5]。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)于乳酸菌青貯添加劑做了大量的研究，研究表明，添加乳酸菌制劑可以提高飼料中乳酸、乙酸的水平，降低氨態(tài)氮和總氮的比值，促進(jìn)多糖和粗纖維的轉(zhuǎn)化，從而改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)[6-8]。但是乳酸菌是一類不形成芽孢的細(xì)菌，因此工業(yè)化生產(chǎn)不宜保存和運(yùn)輸[9]。而芽孢具有極強(qiáng)的抗逆性，能耐熱、紫外線、多種溶劑、酸、堿等[10]，因此在工業(yè)生產(chǎn)中可以保證微生物菌劑的活性，提高其產(chǎn)品質(zhì)量[11]。因此有必要進(jìn)一步研究篩選具有產(chǎn)酸能力的芽孢菌，對(duì)突破乳酸菌的使用“瓶頸”具有重要意義，并對(duì)篩選的菌株進(jìn)行產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，以期提高青貯發(fā)酵的效果，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，為后續(xù)的工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室保藏的200株芽孢桿菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

NA、NB培養(yǎng)基參照程麗娟等(2000)的方法[12]配制，篩選培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基參照劉敏等(2008)的方法[13]配制。

產(chǎn)芽孢優(yōu)化培養(yǎng)基參照許凈凈等(2013)的方法[14]配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的篩選

1.2.1.1 溴甲酚紫平板的制作

篩選培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15 min后，在超凈臺(tái)中，將溴甲酚紫溶液按1.6%～3.0%的比例，經(jīng)0.20 μm的無菌濾頭加入。待溫度下降到40～50℃時(shí)倒入無菌平板中，待凝固即可。

1.2.1.2 初篩

從供試菌株斜面挑取少量菌在溴甲酚紫平板上劃“十”字，于37℃培養(yǎng)24 h，篩選能夠使平板變黃的菌株。

1.2.1.3 復(fù)篩

將初篩所得菌株接種于裝有50 ml種子培養(yǎng)基，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h制成種子液。按6%的接種量接種于100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液于4℃、5 000 r/min離心10 min，通過平板擴(kuò)散法篩選溴甲酚紫平板中黃色溶解圈較大的菌株。

1.2.2 產(chǎn)物鑒定

將通過平板擴(kuò)散法篩選到的產(chǎn)有機(jī)酸最高的菌株發(fā)酵液送到中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部飼料效價(jià)與安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，進(jìn)行有機(jī)酸含量的測(cè)定。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 菌落及菌體形態(tài)觀察

在NA平板上對(duì)菌株菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，并對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.2.3.2 菌株生理生化特性

菌株生理生化特征參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]進(jìn)行。

1.2.3.3 菌株DNA的提取和16S rDNA序列擴(kuò)增與分析

細(xì)菌DNA的提取和PCR擴(kuò)增參照張永輝等（2011）的方法[17]，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京寶銳通生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行Blast分析比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化

1.2.4.1 菌株種子培養(yǎng)

將斜面培養(yǎng)目的菌接種于50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml容量的三角瓶中，于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h后使用。

1.2.4.2 菌株發(fā)酵培養(yǎng)

將種子液按6%的接種量于50 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml容量的三角瓶中，于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取樣觀察芽孢形成率情況。

1.2.4.3 單因素試驗(yàn)

通過改變培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機(jī)鹽確定對(duì)芽孢產(chǎn)量影響顯著的培養(yǎng)基成分[14]。

1.2.4.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化

按正交試驗(yàn)表L9（34）設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的最適碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)培養(yǎng)基的組成進(jìn)行條件優(yōu)化。然后在確定最適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)基的發(fā)酵時(shí)間、接種量、pH值、裝液量進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化[14]。

1.2.4.5 測(cè)定方法

芽孢染色參照沈萍等（1999）方法[18]，并測(cè)定芽孢形成率；采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選

2.1.1 初篩試驗(yàn)結(jié)果

篩選出能夠使培養(yǎng)基變黃的菌株共13株，列舉菌株R42-16、R42-14、R42-10、J51-8如圖1所示 。

圖1 初篩結(jié)果

2.1.2 復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)初篩所得的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵液經(jīng)離心注入篩選培養(yǎng)基的孔中，如圖2所示，菌株R42-16周圍具有明顯的黃色溶解圈，因此本試驗(yàn)選取菌株R42-16作為后續(xù)研究菌株。

圖2 復(fù)篩結(jié)果

2.2 產(chǎn)物鑒定結(jié)果（見圖3及表1）

對(duì)菌株R42-16發(fā)酵液中的乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丁酸進(jìn)行液相色譜分析。由圖3及表1可以看出，菌株代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸主要為乳酸和乙酸，分別達(dá)到174、221 μg/ml。研究表明，大量的乳酸和乙酸可以降低青貯飼料pH值，抑制其他有害微生物的生長(zhǎng)，減少物質(zhì)損失[5]。

表1 有機(jī)酸含量（μg/ml）

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定（見圖4）

由圖4可知，菌株R42-16在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h后，菌落呈乳白色，不透明，圓形，表面十字凸起，干燥，有皺褶。

圖3 乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丁酸（從左到右）液相色譜圖

圖4 R42-16菌株的菌落（左）、菌體（中）、芽孢（右）形態(tài)

菌體形態(tài)呈桿狀，菌體長(zhǎng)約1.7 μm，寬約0.7 μm，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，有芽孢，芽孢呈橢圓形，長(zhǎng)約1.0 μm，寬約0.7 μm。

2.3.2 菌株生理生化試驗(yàn)

對(duì)菌株R42-16生理生化鑒定試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 生理生化鑒定

根據(jù)菌株的形態(tài)鑒定和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定該菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

2.3.3 菌株分子學(xué)鑒定

在NCBI網(wǎng)站上，將得到R42-16菌株的16S rDNA序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

結(jié)合菌株的形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)結(jié)果以及16S rDNA分子鑒定結(jié)果，將R42-16菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.4 R42-16菌株產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化

2.4.1 碳源對(duì)R42-16菌株芽孢產(chǎn)量的影響（見表3）由表3可知，以蔗糖為碳源的芽孢產(chǎn)量最高，玉米粉次之，但考慮經(jīng)濟(jì)效益方面，選擇玉米粉作為培養(yǎng)基的最佳碳源，其芽孢形成率為24.37%，活菌總數(shù)達(dá)3.56×109cfu/ml。

2.4.2 氮源對(duì)R42-16菌株芽孢產(chǎn)量的影響（見表4）

圖5 R42-16菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 不同碳源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

表4 不同氮源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

當(dāng)以酵母浸粉作為氮源時(shí),芽孢形成率達(dá)66.99%，活菌總數(shù)達(dá)1.68×109cfu/ml，芽孢產(chǎn)量達(dá)到1.12×109cfu/ml，因此選擇酵母浸粉作為培養(yǎng)基的最佳氮源。2.4.3 無機(jī)鹽對(duì)R42-16菌株芽孢產(chǎn)量的影響(見表5)

表5 無機(jī)鹽對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響

無機(jī)鹽不僅對(duì)于菌體的生長(zhǎng)具有很大影響，而且對(duì)芽孢的產(chǎn)生也有很大作用。研究表明，Mn2+是菌體生長(zhǎng)和芽孢生成的微量元素，是許多酶的輔助因子，如超氧化物歧化酶、黃嘌呤氧化酶等[11]。由表5可知，當(dāng)以Mn2+作為無機(jī)鹽時(shí)，該菌株產(chǎn)芽孢能力最強(qiáng)，其中芽孢產(chǎn)量達(dá)1.11×109cfu/ml,芽孢形成率和活菌總數(shù)分別為52.55%、2.11×109cfu/ml。其次是CaCl2·H2O，Ca2+的加入可以促進(jìn)菌株生成芽孢，其中芽孢形成率達(dá)到71.81%，因此選擇MnSO4·H2O、CaCl2·H2O作為培養(yǎng)基的最佳無機(jī)鹽。

2.4.4 培養(yǎng)基組成正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果配制不同濃度的培養(yǎng)基,按正交試驗(yàn)表L9(34)設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定芽孢形成率、活菌總數(shù)及芽孢產(chǎn)量，試驗(yàn)結(jié)果見表6。結(jié)果表明，對(duì)芽孢產(chǎn)量影響的主次因素為：酵母浸粉＞CaCl2·H2O＞玉米粉＞MnSO4·H2O。試驗(yàn)中最佳組合為A1B1C1D1，其中芽孢產(chǎn)量達(dá)到1.46×109cfu/ml，但正交優(yōu)化表中最優(yōu)組合為A1B2C1D1，因此需要做驗(yàn)證試驗(yàn)（試驗(yàn)結(jié)果見表7）。

表6 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)

由表7可知，組合A1B1C1D1芽孢形成率為81.12%，活菌總數(shù)為1.77×109cfu/ml，而組合A1B2C1D1，芽孢形成率為82.74%，活菌總數(shù)為1.90×109cfu/ml，因此，組合A1B2C1D1的芽孢產(chǎn)量略高，即最優(yōu)培養(yǎng)基為玉米粉1%、酵母浸粉2%、MnSO4·H2O 0.01%、CaCl2·H2O 0.01%。

2.4.5 培養(yǎng)條件正交優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)間、接種量、pH值、裝液量按正交試驗(yàn)表L9(34)設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表8。由結(jié)果可知，對(duì)芽孢產(chǎn)量影響的主次因素為：裝液量＞pH值＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量。試驗(yàn)組中最佳組合為A1B1C1D1，其芽孢形成率為92.87%，活菌總數(shù)為3.29×109cfu/ml。但正交優(yōu)化表中最優(yōu)組合為A2B1C1D1，因此需要做驗(yàn)證試驗(yàn)（試驗(yàn)結(jié)果見表9）。

由表9可知，組合A1B1C1D1，芽孢形成率為92.09%，活菌總數(shù)為3.22×109cfu/ml，而組合A2B1C1D1，芽孢形成率為93.76%，活菌總數(shù)為3.19×109cfu/ml，組合A1B1C1D1的活菌總數(shù)略高，而組合A2B1C1D1的芽孢產(chǎn)量略高，通過比較芽孢產(chǎn)量，組合A2B1C1D1較高，達(dá) 2.99×109cfu/ml，因此組合 A2B1C1D1為最佳組合，即發(fā)酵時(shí)間48 h、接種量4 ml、pH值 6、裝液量50 ml/250 ml。

3 討論

3.1 菌株的篩選鑒定

近年來，對(duì)玉米秸稈中添加青貯劑做了大量研究。其中有機(jī)酸的含量和種類可以反映青貯品質(zhì)，其中乳酸、乙酸和丁酸是評(píng)價(jià)的重點(diǎn)，乳酸和乙酸可以使青貯初期pH值下降，抑制其他腐敗菌對(duì)蛋白質(zhì)的分解，增加青貯飼料的適口性，故越多越好，而丁酸在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生腐臭味，故越少越好[19-21]。

表8 培養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)

目前大量研究表明，添加乳酸菌可以提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，但對(duì)于乳酸菌的研究機(jī)理目前很少，一些研究主要集中在發(fā)酵產(chǎn)物乳酸和乙酸上[22]。Danner等(2003)[23]曾提出有機(jī)酸對(duì)于青貯飼料的有氧穩(wěn)定性的影響，其中乙酸＞乳酸，在青貯過程中乙酸是一種可以抑制微生物生長(zhǎng)的因子，能夠抑制飼料中霉菌的生長(zhǎng)[24]。但乳酸菌不產(chǎn)芽孢，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)就會(huì)有一定的限制。而本試驗(yàn)篩選獲得的R42-16經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，其中乙酸的含量高達(dá)221 μg/ml，其次是乳酸，達(dá)174 μg/ml，其中丁酸所占比例也比較小，僅8 μg/ml。張建梅等（2012）[25]篩選的產(chǎn)酸芽孢菌株GF1為蠟樣芽孢桿菌，在發(fā)酵10 h時(shí)乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量達(dá)到最高，分別為143、473、26、24 μg/ml，但12 h時(shí)就開始呈下降趨勢(shì)，而菌株R42-16在48 h時(shí)產(chǎn)酸量仍很高，而且丁酸的含量比菌株GF1低。劉敏等（2008）[13]篩選的產(chǎn)酸芽孢菌株L-1為枯草芽孢桿菌，產(chǎn)乳酸、乙酸的量分別為255.11、59.28 μg/ml，雖然乳酸的含量略高，但乙酸含量較少。因此本試驗(yàn)菌株在產(chǎn)酸能力上具有一定的優(yōu)越性。

另外，解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，也是益生菌的一種。范會(huì)蘭等（2009）[26]研究表明：解淀粉芽孢桿菌對(duì)犢牛腹瀉病原菌大腸桿菌有抑制作用。因此用菌株R42-16發(fā)酵后的青貯秸稈飼喂反芻動(dòng)物后還可能起到防治腹瀉的功能，以待進(jìn)一步研究。

3.2 菌株產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化

芽孢是抗逆性休眠體，能耐熱、紫外線、多種溶劑、酸、堿等[10]，在工業(yè)生產(chǎn)中較高的生物量和芽孢產(chǎn)率有利于產(chǎn)品的加工、貯藏，可以保證產(chǎn)品的質(zhì)量[27]。因此，有必要對(duì)優(yōu)化菌株的芽孢形成條件做一研究，在試驗(yàn)過程中以芽孢產(chǎn)量作為參考指標(biāo)，能夠保證菌劑在青貯過程中迅速繁殖。

本試驗(yàn)通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化，在試驗(yàn)過程中，甘露醇、蔗糖、玉米粉為碳源時(shí)，其芽孢產(chǎn)量相差不多，但考慮到經(jīng)濟(jì)問題，選用玉米粉作為碳源；酵母浸粉作為氮源時(shí)，其芽孢形成率、活菌總數(shù)均最高，報(bào)道中很少見，這可能與微生物不同有關(guān)；對(duì)于無機(jī)鹽的篩選，其中Mn2+對(duì)菌株R42-16發(fā)酵生產(chǎn)中芽孢產(chǎn)量影響最大，可能和它是許多酶的活化劑有關(guān)，這與吳逸飛等（2013）[9]研究結(jié)果一致。Ca2+的加入可以促進(jìn)菌株生成芽孢，這與郝慶紅等（2013）[27]研究結(jié)果一致。而Fe2+、Cu2+對(duì)菌體的生長(zhǎng)具有抑制作用，F(xiàn)e2+能夠與一些蛋白酶絡(luò)合，會(huì)直接抑制蛋白質(zhì)分解活性，Cu2+在-CN過量時(shí)，可以與4個(gè)-CN絡(luò)合，進(jìn)而影響酶的穩(wěn)定性。有研究表明，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基突然靜置或添加固體介質(zhì)可以提高芽孢形成率[28]，因此我們將在工業(yè)化生產(chǎn)中進(jìn)一步深入研究，以期完善其生產(chǎn)工藝，提高經(jīng)濟(jì)效益。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)獲得一株產(chǎn)有機(jī)酸的芽孢桿菌，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

通過正交試驗(yàn)得到菌株R42-16產(chǎn)芽孢最佳培養(yǎng)基組成為：玉米粉1%、酵母浸粉2%、MnSO4·H2O 0.01%、CaCl2·H2O 0.01%。最佳培養(yǎng)條件為：發(fā)酵時(shí)間 48 h、接種量4 ml、pH值 6、裝液量 50 ml/250 ml。此條件下芽孢形成率為93.76%、活菌總數(shù)為3.19×109cfu/ml、芽孢產(chǎn)量達(dá)2.99×109cfu/ml，達(dá)到了菌株芽孢優(yōu)化的預(yù)期效果。本試驗(yàn)芽孢優(yōu)化所得參數(shù)，可為菌株R42-16大規(guī)模的生產(chǎn)提供參考。