南文龍，張悅勇，陳義平

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

PCR假陽性的原因分析及控制措施

南文龍，張悅勇，陳義平

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

近二十年來，PCR作為一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動物疫病的病原學(xué)、診斷方法、基因工程疫苗研究、檢驗檢疫、疫病診斷、疫情監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查等動物疫病防控實際工作。如何控制好PCR檢測的質(zhì)量，減少假陽性，一直是研究者普遍關(guān)注的問題。本文分析了PCR假陽性形成的原因，提出預(yù)防及控制措施，為促進實驗室PCR實踐工作提供參考。

PCR；假陽性；原因分析；控制措施

PCR是一種快速、敏感的分子檢測方法，通過使用特定的引物，將微量的模板DNA在DNA聚合酶作用下進行指數(shù)擴增，再對擴增放大后的“信號”進行識別，大大提升了對病原微生物的檢測能力。各省、市級動物疫病防控機構(gòu)及規(guī)?；B(yǎng)殖企業(yè)普遍配置PCR儀，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于檢驗檢疫、疫病診斷、疫情監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查等動物疫病防控工作。

假陽性是指檢測陰性樣品時，得出陽性結(jié)果。PCR技術(shù)具有較高的敏感性，這是其突出的優(yōu)勢，但也容易出現(xiàn)假陽性，被檢樣品即使污染了微量的模板核酸，也會被檢測為陽性。1988年，Lo等[1]首次報道了PCR假陽性，在檢測HBV過程中，由于PCR引物污染了含有HBV全長基因的質(zhì)粒，導(dǎo)致檢測時出現(xiàn)假陽性。在PCR檢測中，如何有效避免假陽性、控制并去除潛在的風險，一直是研究者普遍關(guān)注的問題。本文擬分析討論PCR假陽性形成的原因，提出預(yù)防及控制措施，為促進實驗室PCR實踐工作提供參考。

1 假陽性形成的原因

一般來說，假陽性多數(shù)是由污染造成的。

1.1 “一般性污染”造成的假陽性

“一般性污染”指模板核酸污染于試劑、耗材、設(shè)備或環(huán)境。若這種情況發(fā)生，通常每個檢測樣品都會受到污染，而污染后的樣品檢測均為陽性，這也是導(dǎo)致PCR檢測假陽性發(fā)生的主要原因之一[2]。這種類型的污染大致可分為兩類，第一類是“工廠源性的污染”，指試劑、耗材在出廠時已經(jīng)發(fā)生污染，原因可能是其制備過程中或在工廠環(huán)境里受到污染。很多試劑和酶的制備過程涉及使用酵母、真菌（如溶細胞酶），而在DNA提取時如使用受污染的試劑處理檢測樣品，就會導(dǎo)致假陽性的發(fā)生。Rimek等[3]發(fā)現(xiàn)，來源于2個不同廠家的不同批次的溶細胞酶，都含有真菌DNA，采用真菌通用引物經(jīng)PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)其序列與多種酵母（釀酒酵母、巴氏酵母、奇異酵母等）基因序列100%同

源。此外，還有10× PCR buffer污染頂孢霉屬真菌、Taq DNA聚合酶污染細菌DNA、核酸提取柱污染軍團桿菌等報道。

第二類是“實驗室源性的污染”，指污染發(fā)生在實驗室內(nèi)，主要污染物包括PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒、微生物等。具體如下：第一，實驗室環(huán)境本身存在多種微生物（如曲霉等），如DNA提取時發(fā)生真菌孢子污染，可導(dǎo)致假陽性發(fā)生。第二，在同一實驗室、或相鄰實驗室（甚至是樓上、樓下）開展與PCR檢測相關(guān)的微生物培養(yǎng)、核酸樣品制備、質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物分析等工作造成污染。污染物通過空氣流動或人員活動，污染實驗室環(huán)境、設(shè)施設(shè)備、耗材等，最終污染到檢測樣品。第三，在檢測操作過程中發(fā)生污染，如用手直接接觸試劑、耗材、設(shè)備設(shè)施，或未配戴口罩交談?wù)f話，都有可能發(fā)生人源DNA成分的污染。

1.2 “樣品性污染”造成的假陽性

“樣品性污染”指模板核酸以“樣品—樣品”的方式污染到其他樣品中，這種類型的污染一般影響較為局限，僅影響部分檢測樣品或單次檢測結(jié)果[2]。包括：樣品使用前不離心，使用時使勁打開離心管蓋，形成液體飛濺或氣溶膠，造成局部環(huán)境污染；試驗流程不合理，先處理陽性對照或是高濃度核酸樣品，造成低濃度核酸樣品的污染；移液器操作不當，樣品液體倒吸入移液器中，再污染到其他樣品；沒有正確、及時處理試驗后的廢棄物，敞開袋口，導(dǎo)致局部環(huán)境的污染；瓊脂糖凝膠加樣時，陽性PCR產(chǎn)物泄漏到鄰近的加樣孔等。

1.3 其他原因造成的假陽性

這種類型的假陽性并不需要存在模板核酸的污染，而是由于PCR反應(yīng)條件優(yōu)化不佳而產(chǎn)生非特異性擴增，或是盡管反應(yīng)條件都優(yōu)化完善但方法本身的特異性達不到100%[2]。此外，實驗人員的技術(shù)能力也是產(chǎn)生假陽性的重要因素，如熒光定量PCR結(jié)果判定時，閾值取舍不合適，會直接導(dǎo)致假陽性的發(fā)生。

2 防控假陽性的措施

在選擇預(yù)防和控制假陽性的措施時，要根據(jù)假陽性產(chǎn)生的原因來具體對待，核心是防止污染。

2.1 實驗室管控

建議將PCR檢測實驗室分隔為試劑儲存和準備區(qū)、樣品處理區(qū)、基因擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)4個獨立的工作區(qū)域[4]。有條件的實驗室，各功能區(qū)可設(shè)置獨立隔間，并加裝壓力系統(tǒng)，通過不同的壓力流向和強度控制各分區(qū)的氣流，以防止空氣中核酸污染及擴散。每個分區(qū)設(shè)獨立的移液器、吸頭、離心管、一次性手套、工作服等，不要交叉使用。試驗操作時，按照技術(shù)流程，沿相應(yīng)的功能區(qū)單向流動。同時，應(yīng)關(guān)注同實驗室內(nèi)、以及不同實驗室間人員的頻繁流動，以防止因人員活動而引起的污染。

2.2 試劑、耗材管控

選擇質(zhì)量可靠的試劑，了解試劑的性能及各項指標是否符合要求，每批購進的試劑做陰、陽性對照試驗，質(zhì)量合格方可使用，避免因性能問題而導(dǎo)致的非特異性擴增[5]。可將試劑進行小量分裝，一方面避免試劑反復(fù)凍融造成性能下降，另一方面減少打開試劑反應(yīng)管的次數(shù)，避免污染?？蛇x用一些具有抗污染功能的試劑，如用dUTP替代dTTP，在PCR反應(yīng)前加入尿嘧啶糖基酶（UNG酶）進行處理，可以有效防止環(huán)境中PCR產(chǎn)物氣溶膠對檢測體系的污染。PCR試劑、反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不能放于同一冰箱內(nèi)[5]。

使用一次性耗材，如吸頭、移液管、離心管等，降低污染的可能性。選用帶有濾芯的吸頭，可避免陽性樣品DNA對移液器的污染。但應(yīng)注意，一次性耗材并不意味著沒有污染，Schmidt等[6]發(fā)現(xiàn)，不同廠家來源的一次性反應(yīng)管的污染率在20%到80～90%，其最主要的污染物是人源DNA成分。如果不是使用一次性耗材，必須做好消毒及處理工作，但必須注意有些消毒方式（如高壓消毒），并不能完全消除耗材表面的DNA成分。

2.3 檢測操作管控

在選擇檢測方法時，優(yōu)先選擇以國際、區(qū)域、國家或行業(yè)標準發(fā)布的方法；當需要自行建立檢測方法時，必須經(jīng)過驗證和確認后才能予以應(yīng)用[5]；定期開展實驗室間比對也是不可或缺的外部質(zhì)量控制手段。通過上述措施保證所用檢測方法的敏感、特異，減少假陽性的出現(xiàn)。此外，優(yōu)先選擇熒光定量PCR類方法，一方面是由于熒光方法通常比常規(guī)PCR特異性更好，另一方面由于其結(jié)果判定時

不需要打開管蓋，大大降低了污染的可能；可選用自動化核酸提取設(shè)備，也能減少樣品處理過程中污染概率[7]。

實驗人員需經(jīng)過必要的技術(shù)培訓(xùn)，檢測操作時嚴格遵守規(guī)程，優(yōu)化各項具體操作，遇到污染的情況能及時進行處理。具體包括：收集的樣品送往實驗室過程中，應(yīng)當保存于合適的密閉系統(tǒng)中；用于PCR檢測的樣品應(yīng)單獨保存，并防止開蓋另作它用；佩戴手套、口罩等，防止直接接觸或飛沫污染；試劑、樣品使用前要瞬時離心，小心打開離心管蓋，保證濃度的準確且防止液體飛濺或形成氣溶膠；操作時須仔細認真，防止試劑被污染、樣品間的交叉污染 ；樣品加樣時，遵循從低濃度到高濃度的順序，最后加陽性對照；在保證結(jié)果有效的情況下，盡量減少PCR的循環(huán)數(shù)；設(shè)計好實驗對照，一旦出現(xiàn)假陽性結(jié)果便于排查原因；實驗結(jié)束后，廢棄物及時按醫(yī)療垃圾處理，防止污染。

2.4 污染清除

2.4.1 酶處理。許多酶都具有破壞PCR反應(yīng)液中DNA的能力，如DNase I、核酸外切酶III及限制性酶等。通過添加酶，DNA可以被降解，而DNA聚合酶活性不受影響。采用這一方法時，需在上述酶滅活后，再加入模板核酸 ，但要注意再開蓋的過程會增加污染的可能性[2]。

2.4.2 照射。紫外線照射可以用來清除耗材、實驗區(qū)環(huán)境、設(shè)施設(shè)備表面的核酸污染。其原理是氧化作用誘導(dǎo)了DNA單、雙鏈斷裂，相鄰的嘧啶堿基之間形成環(huán)丁烷-嘧啶二聚體，抑制DNA聚合酶介導(dǎo)的DNA鏈延伸。但紫外線去除核酸的效果取決于距離、強度、波長、曝光時間等因素。紫外線照射可作為一種預(yù)防措施，但不能替代良好的實驗操作習慣[2]。

2.4.3 清潔劑。最常用的清潔劑是0.1%次氯酸鈉，常用于實驗區(qū)設(shè)施設(shè)備的清潔，其機制也是氧化作用。Prince等[8]研究表明，0.08%次氯酸鈉作用5分鐘，可以清除76 bp大小的核酸片段。但要取得良好的效果，需保證次氯酸鈉是新鮮配制的。

2.5 PCR陽性結(jié)果解釋和利用時需注意的問題

在控制好假陽性的同時，我們對真實的PCR陽性結(jié)果進行解釋時，也應(yīng)持審慎的態(tài)度。PCR擴增技術(shù)敏感性很高，將微量的信號放大，但有時并不具有臨床意義，一方面微量微生物的感染并不會導(dǎo)致最終的臨床發(fā)病，另一方面即使是死亡或降解的微生物都有可能產(chǎn)生PCR陽性的結(jié)果[2]。相關(guān)研究表明，按標準診斷方法獲得的臨床檢測結(jié)果有時與PCR結(jié)果并不一致[9]。因此，對某種疾病診斷時，須參照相關(guān)標準或技術(shù)規(guī)范所規(guī)定的該病確診條件來進行。

3 小結(jié)

PCR檢測由于其快速、敏感的優(yōu)勢而得到廣泛應(yīng)用。做好PCR檢測的質(zhì)量控制，減少假陽性，需從人員、實驗室、試劑、耗材、檢測方法、檢測過程等多個環(huán)節(jié)全面考慮，且“防重于治”。一旦出現(xiàn)因污染導(dǎo)致的假陽性，一方面排查原因較為困難，另一方面即使找到原因根除污染也很不易。在實際工作中，可以根據(jù)本文所述，綜合運用多種防控措施以減少及消除假陽性，確保PCR檢測結(jié)果的可靠。

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[8] Prince AM，Andrus L. PCR：how to kill unwanted DNA[J]. Biotechniques，1992，12（3）：358-360.

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（責任編輯：胡藕祥）

Cause Analysis and Control Measures for False-positive Reactions in PCR Assays

In the past two decades，as an important technology in molecular biology，PCR has been widely used in the research，prevention and control of animal diseases. How to control the quality of PCR assays and reduce the false-positive rate，are always the problems concerned by the researchers. To promote the laboratory PCR practice，the reasons for formation of PCR false-positive results，were analyzed in this paper and the prevention and elimination measures were recommended.

PCR；false-positive；cause analysis；control measures

Q7

A

1005-944X（2015）08-0056-03