王鴻周，施巧婷，王二耀，馮亞杰，陳付英，吳姣，趙洪昌，徐照學(xué)*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450008)

綜 述

種公牛精液冷凍保存的研究進(jìn)展

王鴻周1,2，施巧婷2，王二耀2，馮亞杰2，陳付英2，吳姣1,2，趙洪昌1,2，徐照學(xué)2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450008)

本文分析從精子的生理特性,冷凍保存的原理,不同稀釋液對(duì)精子冷凍效果的影響,抗氧化劑在種公牛精液冷凍保存中的應(yīng)用進(jìn)展,不同保存環(huán)境對(duì)解凍后精液品質(zhì)的影響等方面綜述了公牛精液冷凍,保存解凍的研究進(jìn)展。

公牛精液;冷凍保存;研究進(jìn)展

國(guó)家十二五規(guī)劃，提倡肉牛養(yǎng)殖鼓勵(lì)進(jìn)行集中育肥，大力向?qū)I(yè)化和規(guī)?；瘶?biāo)準(zhǔn)養(yǎng)殖發(fā)展靠攏,提升肉牛養(yǎng)殖的生產(chǎn)效率。優(yōu)秀種公牛在肉牛種群的繁殖改良和生產(chǎn)發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，精液冷凍技術(shù)則為更好地發(fā)揮種公牛的作用提供了有力的保證，冷凍精液是廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代畜牧業(yè)中的一項(xiàng)重要技術(shù)，它克服了時(shí)間、地域和年齡對(duì)種公牛利用的限制，極大地增加了優(yōu)秀種公畜的利用效率和范圍[1]。牛的冷凍技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用,源自于1951年,世界上第一頭通過冷凍精液進(jìn)行人工授精牛犢的成功誕生[2]，隨后人們開始對(duì)精液冷凍的各個(gè)步驟包括稀釋液配方、稀釋倍數(shù)和稀釋方法、甘油濃度、精液平衡溫度和時(shí)間、降溫速度以及解凍方法等進(jìn)行研究，促使精液冷凍技術(shù)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，我國(guó)于1958年開始精液冷凍技術(shù)的研究，到目前為止對(duì)牛的精液冷凍保存研究已較為成熟，商業(yè)化凍精生產(chǎn)也較為普遍，但對(duì)精液冷凍技術(shù)的研究還需要深入，以解決精液冷凍-解凍后精子質(zhì)量達(dá)不到理想效果的問題。本文通過對(duì)最新的牛精液冷凍技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，期望對(duì)生產(chǎn)中牛精液的冷凍和保存提供一定的參考,以提高冷凍精液的品質(zhì)。

1 精子的生理特性

精子是一種雄性配子，在睪丸的曲精細(xì)管內(nèi)產(chǎn)生形成，經(jīng)睪丸網(wǎng)到達(dá)附睪，完成其成熟過程，精子的形成過程是一種復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)變化，雄性動(dòng)物的遺傳物質(zhì)經(jīng)過精子來傳遞，精子可以在體外一定條件下維持受精能力，這使得精液在體外保存成為可能。精子從睪丸內(nèi)生成到受精完成，伴隨環(huán)境的改變，精子也會(huì)發(fā)生對(duì)應(yīng)的生理變化。精清是種公牛在射精時(shí)運(yùn)載精子并對(duì)精子有保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)作用的物質(zhì)，由少量睪丸液、附睪液及各種副性腺的分泌物組成。精清中含有各種提供能量的糖類、調(diào)節(jié)滲透壓平衡的檸檬酸和其他有機(jī)成分，和與受精有關(guān)的乳酸、尿酸、醋酸、乙醇酸等微量有機(jī)酸及抗壞血酸等，還有調(diào)節(jié)代謝的蛋白質(zhì)、氨基酸和酶類，此外，還有核酸、脂類、脂肪酸和對(duì)精子防凍有保護(hù)作用并延長(zhǎng)精子存活時(shí)間的前列腺素、鈉鉀等無機(jī)成分和維生素。有些成分的功能和作用已經(jīng)研究清楚，例如，牛精液中已分析過的維生素有硫胺素、核黃素、抗壞血酸、泛酸等，這些成分的存在有利于提高精子的活力和密度。有些成分(如維生素B12和維生素E類似物)對(duì)精子有抗凍保護(hù)的作用機(jī)理尚不清楚還需要繼續(xù)深入研究。精清是精子體外生存的環(huán)境，其成分應(yīng)和精子的生理需要相符[3]。生產(chǎn)中應(yīng)充分了解精子的理化特性，以及所含營(yíng)養(yǎng)成分的含量、種類及功能，對(duì)精子和精清兩者之間的關(guān)系則應(yīng)進(jìn)行更加深入的研究。

2 精液的冷凍保存原理

精液冷凍保存是利用液氮(-196℃)、干冰(-79℃)或其他冷源將精液經(jīng)過適當(dāng)處理后，保存在超低溫條件下，以達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的，精子保存在超低溫狀態(tài)下，其代謝活動(dòng)完全受到抑制，只是生命以相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)保持下來，當(dāng)溫度改變升溫解凍后則又能復(fù)蘇并還具有受精能力。精子之所以能夠復(fù)蘇的關(guān)鍵在于精液在冷凍過程中加入了冷凍保護(hù)劑，在冷凍劑的作用下，使得精子水分冰晶化對(duì)精子造成的破壞大幅度減少，而形成玻璃化[4]。關(guān)于精液冷凍保存的具體機(jī)制尚不清楚，目前有五種代表性的假說[5]，這些假說都各自揭示了細(xì)胞在冷凍過程中受到的冷凍損傷原理。冷凍蝕刻技術(shù)表明冷凍細(xì)胞受到冰晶排擠后處于高滲透壓的環(huán)境之中，從而導(dǎo)致細(xì)胞失水萎縮，離子不平衡，在解凍過程中造成細(xì)胞腫脹，胞膜破裂[6]，從而對(duì)精細(xì)胞造成損傷。在精液冷凍時(shí)要防止冰晶的形成，需采取有效的方式快速度過冰晶期，在生產(chǎn)凍精時(shí)，首先應(yīng)在3～5℃冰柜平衡分裝，然后在-90～-130℃冷凍溫度熏蒸7～8 min，最后放于-196℃液氮中保存，使精液經(jīng)凍結(jié)處理后能較完整地保存精子的結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能。在超低溫(-196℃)條件下，凍精物理化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定，精子處于長(zhǎng)期休眠狀態(tài)，凍精經(jīng)過解凍后就會(huì)復(fù)蘇，便具有較強(qiáng)的生理機(jī)能[7]。

3 不同稀釋液對(duì)精子冷凍效果的影響

目前對(duì)精液稀釋液的研究已有很多，都是旨在研究篩選出適合不同品種的最佳稀釋液配方，以提高精液冷凍的效果。趙家才等[8]對(duì)BMY牛冷凍精液的稀釋液進(jìn)行篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以TRIS-果糖為基礎(chǔ)液經(jīng)過添加不同的糖類和氨基酸所得的新稀釋液獲得了較好的效果，其中添加蔗糖和乳糖的效果較為明顯，添加氨基酸取得的效果不太理想。稀釋液的種類和配方對(duì)冷凍精液的效果非常重要，組成稀釋液的主要成分包含糖類、鹽類、蛋白類及一些抗凍保護(hù)劑。常用的糖類有葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖等，稀釋液的糖類物質(zhì)不僅為精細(xì)胞提供能量，還具有一定的防凍作用，Woelders等[9]發(fā)現(xiàn)，海藻糖和蔗糖都具有在冷凍環(huán)境下保護(hù)精子免受傷害的作用，而蔗糖的保護(hù)效果更好。卵黃對(duì)精子抗凍保護(hù)也具有重要作用，卵黃配合抗凍劑甘油對(duì)精液的冷凍保存具有重要的作用，然而也有不使用卵黃的，Moussaa等[10]發(fā)現(xiàn)在牛精子冷凍過程中，可以利用抗低溫打擊能力強(qiáng)的低密度脂蛋白(LDL)代替卵黃的作用，而且其冷凍精液效果也較好。LDL對(duì)精子的保護(hù)作用機(jī)理是通過脂質(zhì)與精子膜結(jié)合，防止細(xì)胞膜的完整性受到破壞。只是目前無卵黃稀釋液價(jià)格較高，出于經(jīng)濟(jì)效益的考慮，有些種公牛站又開始使用有卵黃稀釋液。稀釋液中卵黃的添加量一般在15%～20%，必須進(jìn)行充分?jǐn)嚢杌靹騕11]。也有運(yùn)用卵磷脂代替卵黃的研究，并取得了良好的效果[12]，卵磷脂也具有一定的抗氧化和延緩衰老的作用[13]。胡傳活等[14]發(fā)現(xiàn)以含1.5%、3%、4.5%及6%四種不同濃度的卵磷脂稀釋液冷凍牛的精液，除了含6%卵磷脂試驗(yàn)組外，其余3個(gè)試驗(yàn)組都可獲得與含20%卵黃的常用稀釋液相當(dāng)或更好的精液質(zhì)量，其中含1.5%卵磷脂的稀釋液效果最好。甘油作為常用的冷凍保護(hù)劑，冷凍效果雖好，但因其對(duì)精細(xì)胞有一定的毒害作用，甘油濃度影響種公牛精液冷凍后活力和頂體完整率[15]，生產(chǎn)中運(yùn)用一步稀釋法能達(dá)到理想的效果[16]，對(duì)于有條件的種公牛站可以采用二步稀釋法，解凍后要注意去除甘油再進(jìn)行人工授精，以減少對(duì)精細(xì)胞的損傷。目前，對(duì)于甘油替代品的研究開發(fā)仍需繼續(xù)研究。目前國(guó)內(nèi)外稀釋液的種類很多，研究發(fā)現(xiàn)[17]進(jìn)口稀釋液和國(guó)內(nèi)稀釋液對(duì)奶牛和肉牛冷凍精液的活率和畸形率影響不大，但是使用國(guó)內(nèi)稀釋液稀釋的奶牛和肉牛精液的頂體完整率顯著高于使用稀進(jìn)口釋液稀釋的奶牛和肉牛精液的頂體完整率，受胎率也較好。

4 抗氧化劑在種公牛精液冷凍保存中的應(yīng)用進(jìn)展

在冷凍-解凍過程中會(huì)產(chǎn)生對(duì)精細(xì)胞有害的活性氧(ROS)物質(zhì)，精細(xì)胞的氧化損傷程度與精子冷凍效果有密切關(guān)系[18]，ROS對(duì)精細(xì)胞的損傷機(jī)制是：在正常條件下，精子的ROS量處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在精液的冷凍一解凍過程中因精子與外界環(huán)境相接觸，由于外界各種因素的相互作用，增加了死亡精子和受損精子的數(shù)量，致使這種平衡被打破，導(dǎo)致產(chǎn)生過多的ROS，精子ROS量增加，引起精子膜的流動(dòng)性改變，線粒體和DNA損傷，從而，引起精液品質(zhì)降低[19]，再者，雖然在精漿中存在能夠清除ROS的抗氧化酶，但牛精子本身并不含有過氧化氫酶，含有的谷胱甘肽過氧化酶也較少，不足以抵抗ROS的作用[20]，這就需要在牛精液冷凍過程中添加抗氧化劑來保護(hù)精細(xì)胞減弱ROS的損傷?？寡趸瘎┑姆N類主要有維生素類、酶類和其他抗氧化劑。Ollero等[21]研究發(fā)現(xiàn)，維生素E是機(jī)體中重要的抗氧化劑，能提高精子頂體完整率和降低精子畸形率，且能提高凍精解凍后的精子活力。趙憲林等[22]研究發(fā)現(xiàn)在我國(guó)秦川牛精子稀釋液中添加維生素E顯著提高了冷凍精液解凍后的精子活力，精液品質(zhì)明顯得到改善。并且，在我國(guó)秦川牛精子稀釋液中添加維生素E的適宜添加量為0.04～0.08 mg/mL。張鶯鶯等[23]研究在稀釋液中添加中藥提取液發(fā)現(xiàn)，牛精子的活率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率都有較好的效果，這主要是因?yàn)槠渲兴幊煞种泻胸S富的天然抗氧化劑和其他對(duì)抑制脂類氧化反應(yīng)具有增效作用的物質(zhì)，這些成分在抵御脂類物質(zhì)氧化損傷和保護(hù)精子質(zhì)膜完整性上起到了積極作用。然而，中草藥成分在精子冷凍時(shí)的積極作用機(jī)理有待于進(jìn)一步的研究。褪黑激素可以刺激過氧化岐化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的抗氧化酶活性，它不僅具有高親脂性還具有部分親水性，能夠抑制過氧化氫引起的過氧化脂質(zhì)含量的升高，有效清除在化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的羥自由基，在精液冷凍過程中發(fā)揮著重要的抗氧化作用[24]，它對(duì)不同類型的細(xì)胞都有抗氧化和抗凋亡作用[25]。李曉霞等[26]研究發(fā)現(xiàn)添加褪黑激素可以抑制ROS誘發(fā)的精子氧化損傷，提高精子活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性，對(duì)提高牛精液的保存質(zhì)量和保存時(shí)間具有顯著作用，其適宜添加量為10-3 mol/L。目前，對(duì)抗氧化劑的研究主要集中于單獨(dú)加入抗氧化劑的研究方面，不同抗氧化劑聯(lián)合在家畜精液冷凍保存中的應(yīng)用則少有報(bào)道，各抗氧化劑之間是否有協(xié)同作用的研究也較少，特別是維生素類和酶類抗氧化劑的聯(lián)合應(yīng)用，應(yīng)該加大不同抗氧化劑聯(lián)合應(yīng)用，以便更好的改善冷凍解凍后的精子質(zhì)量[27]。李志凌等[28]研究人的精子冷凍儲(chǔ)存發(fā)現(xiàn)，在精液進(jìn)行冷凍處理前進(jìn)行精子優(yōu)選，將死精子和劣質(zhì)精子去除，可以顯著減少冷凍-解凍過程中ROS產(chǎn)生，說明精液優(yōu)選對(duì)精液冷凍保存具有顯著的作用。目前，精子優(yōu)選方法在牛精液的冷凍保存上尚未見報(bào)道，分析其原因可能是精液優(yōu)選會(huì)增加冷凍生產(chǎn)強(qiáng)度，增加成本，建議在以后的牛精液冷凍研究中嘗試使用精子優(yōu)選的方法，研究其對(duì)牛精液冷凍效果的影響，簡(jiǎn)化其操作過程，使其能夠運(yùn)用于牛的冷凍精液生產(chǎn)中。

5 不同保存環(huán)境對(duì)解凍后精液品質(zhì)的影響

張晉青等[29]研究了青藏高原牛冷凍精液超長(zhǎng)期保存的效果，發(fā)現(xiàn)精子冷凍保存長(zhǎng)達(dá)35年，在解凍后進(jìn)行生產(chǎn)使用，仍可以產(chǎn)生后代，且后代犢牛生活力強(qiáng)、采食好、生長(zhǎng)快，未出現(xiàn)任何遺傳上的異常情況。說明液氮超低溫保存精液是保存生物遺傳資源的一種有效方法，也是建立生物基因庫(kù)的重要手段，但應(yīng)避免多次取拿，因?yàn)槎啻稳∧脮?huì)引起精液所處溫度發(fā)生變化，對(duì)精細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致活力降低。解凍后的精液與超低溫保存相比，存活時(shí)間會(huì)明顯縮短，聶德寶等[30]對(duì)精液品質(zhì)的影響研究了不同保存環(huán)境對(duì)牛解凍后精液品質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，解凍后0.5 h的時(shí)候，保存在冰水以及30℃的精子活力沒有明顯差異，精子的活力均在合格范圍內(nèi)。但在2 h以后就出現(xiàn)了顯著差異，在30℃環(huán)境中的精子活力明顯降低了，低于0.35的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，而冰水中的精子活力沒有明顯的變化。由于培養(yǎng)時(shí)間短，細(xì)菌菌落數(shù)變化不明顯。孫光華等[31]在0～5℃、24～27℃兩個(gè)溫度范圍進(jìn)行了精液解凍后保存試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以0～5℃范圍解凍后保存效果較好，存活時(shí)間可達(dá)12 h，常溫(24～27℃)解凍后存活時(shí)間僅為4 h。潘和平等[32]通過研究早勝牛的冷凍精液發(fā)現(xiàn)，早勝牛在75℃解凍精子活率最高，但保存時(shí)間不長(zhǎng)，只適用于體溫短時(shí)問保存并立即進(jìn)行輸精，而38℃解凍后保存于0～5℃的條件下，精子保持活力的的時(shí)間最長(zhǎng)。高春國(guó)等[33]研究曲靖肉牛的冷凍精液發(fā)現(xiàn)，精液解凍后在低溫( 4℃)保存6 h，常溫( 10～15℃)保存4 h和高溫( 28℃)保存2 h以內(nèi)輸精對(duì)受胎率沒有顯著的影響，凍精解凍后在高溫28℃)保存4 h以上，受胎率會(huì)明顯下降。說明保存溫度對(duì)凍精解凍后精子壽命影響很大。在實(shí)際使用冷凍精液進(jìn)行人工授精操作中，應(yīng)根據(jù)操作場(chǎng)地和種公牛站的距離遠(yuǎn)近，技術(shù)設(shè)施條件，合理選擇精液解凍后的保存溫度，以保持精液在受精時(shí)具有較高的活率。

6 小結(jié)

精液冷凍保存受各種因素的影響，要想取得理想的冷凍效果，就必須注意把握影響精液品質(zhì)的各個(gè)環(huán)節(jié)。不同品種的種公牛、以及同一品種的不同個(gè)體間精液質(zhì)量也有顯著差異，應(yīng)盡量避免夏季對(duì)種公牛的利用，夏季高溫會(huì)影響種公牛的精液品質(zhì)，使精液品質(zhì)下降。同時(shí)應(yīng)注意加強(qiáng)對(duì)種公牛的飼養(yǎng)管理，在接種疫苗后注意讓種公牛有一個(gè)恢復(fù)休息期[34]，注意采精頻率和采精方法[35]的應(yīng)用。也有采集放牧散養(yǎng)牛的精液，經(jīng)過處理稀釋處理后過一段時(shí)間帶回種公牛站進(jìn)行冷凍的研究[36]，證明牛精液在采集后經(jīng)過適當(dāng)處理，可以保存一定的時(shí)間再進(jìn)行冷凍保存，這可以解決生產(chǎn)中和種公牛站距離較遠(yuǎn)的種牛精液保存問題，但在提高效率方面還需要進(jìn)一步的細(xì)化研究。在精液冷凍保存的過程中應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程來做，選擇合理的稀釋液配方，注意對(duì)冷凍過程中溫度的把握，以取得良好的冷凍效果。進(jìn)行人工授精之前，應(yīng)對(duì)解凍后的精液進(jìn)行品質(zhì)檢查，不符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的堅(jiān)決不能進(jìn)行輸精操作。冷凍、解凍和輸精過程中要嚴(yán)格無菌操作，避免因感染降低受精率。

種公牛的精子冷凍技術(shù)研究，需要多借鑒其他畜種包括人類的冷凍技術(shù)研究方法和新技術(shù)。根據(jù)不同的牛品種選擇合理的精液冷凍研究方法，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)確定各個(gè)營(yíng)養(yǎng)成分的最適添加量，優(yōu)化稀釋液配方以獲得高品質(zhì)的冷凍精液。對(duì)稀釋液有些成分的作用機(jī)理不太清楚，還需要進(jìn)行更加深入的實(shí)驗(yàn)研究，以進(jìn)一步增加了解。種公牛站應(yīng)加強(qiáng)對(duì)技術(shù)人員的培訓(xùn)，嚴(yán)把精液生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，加強(qiáng)新技術(shù)的應(yīng)用，及時(shí)解決遇到的問題，生產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)良的凍精。

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Research Progress of Semen Cryopreservation of Bulls

WANG Hong-zhou, SHI Qiao-ting, WANG Er-yao, FENG Ya-jie, CHEN Fu-ying,WU Jiao, ZHAO Hong-chang, XU Zhao-xue

(1.DepartmentofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou, 450002,China;2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou450008,China)

This article reviewed the research progress of semen cryopreservation of bulls, including saving and thawing from many aspects, such as physiological characteristics of the sperm, the principle of cryopreservation. Moreover, the following aspects were included, such as the influence of different diluents on sperm freezing effect, the application progress of using antioxidant in bulls' semen cryopreservation and the influence of semen quality after thawing under different keeping environment.

Bull; Semen; Cryopreservation; Research Progress.

中國(guó)牛業(yè)科學(xué)2015，41(1)：68?70；75ChinaCattleScience綜 述

中國(guó)牛業(yè)科學(xué)2015，41(1)：61?67ChinaCattleScience綜 述

2014-11-20

2014-12-15

國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系/河南省肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助。

王鴻周(1990-)，男，河南濮陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：家畜繁殖育種。E-mail:415288255@qq.com。

*通訊作者：徐照學(xué)(1961-)，男，陜西華縣人，博士研究員，主要從事家畜繁殖育種技術(shù)研究。E-mail:xuzhaoxue11@163.com

S814.4

A

1001-9111(2015)01-0057-04