王瑞芳李雪君潘小燕陳韓英

1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2.新疆奇康哈博維藥股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830026

百癬夏塔熱軟膏中槲皮素與沒食子酸的含量測(cè)定及穩(wěn)定性研究

王瑞芳1，2李雪君2潘小燕2陳韓英1*

1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2.新疆奇康哈博維藥股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830026

目的：建立百癬夏塔熱軟膏高效液相色譜測(cè)定方法，并考察該制劑的穩(wěn)定性。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定軟膏中槲皮素和沒食子酸的含量，考察濕度、光照及溫度對(duì)百癬夏塔熱軟膏穩(wěn)定性的影響。結(jié)果：槲皮素在0.04～0.4μg／ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；沒食子酸在0.02～0.2μg／ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；百癬夏塔熱軟膏對(duì)濕度和強(qiáng)光照射不敏感；于40℃、75%濕度下加速實(shí)驗(yàn)，第6個(gè)月外觀發(fā)生變化，含量明顯下降。結(jié)論：建立的方法具有簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)；該制劑對(duì)強(qiáng)光及高濕不敏感，室溫密閉保存含量穩(wěn)定。

百癬夏塔熱軟膏；槲皮素；沒食子酸；高效液相色譜法；穩(wěn)定性

百癬夏塔熱軟膏為外用制劑，處方來(lái)源于 《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)—維吾爾分冊(cè)》中收載的傳統(tǒng)維藥百癬夏塔熱片。具有清除異常粘液質(zhì)、膽液質(zhì)及敗血，消腫止癢的功效。臨床用于治療手癬、體癬、足癬、花斑癬、銀屑病、過(guò)敏性皮炎、帶狀皰疹、痤瘡等［1］。方中君藥地錦草的主要有效成分為槲皮素，訶子肉、毛訶子肉、西青果的主要有效成分均為沒食子酸，所以我們選用槲皮素和沒食子酸作為含量測(cè)定指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定軟膏中槲皮素和沒食子酸的含量，并考察光照、溫度及濕度等因素對(duì)百癬夏塔熱軟膏穩(wěn)定性的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2010A HT高效液相色譜儀（日本島津）；BT25S十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料 槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081－200406）、沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：11083－200302）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。百癬夏塔熱軟膏（批號(hào)：130320、130321、130322，新疆奇康哈博維藥有限公司研究院）。甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 槲皮素的含量測(cè)定

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100－5 C18 column（150mm×4.6mm）；流動(dòng)相：甲醇－0.4%磷酸溶液（50：50）；柱溫：25℃；流速：1m l／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：370nm。

2.2 供試品溶液的制備 取百癬夏塔熱軟膏約1g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50ml，稱定重量，置于80℃水浴中保持10min，并不停震蕩，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取槲皮素對(duì)照品5mg，置50m l容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液1、2、4、6、8、10m l移至25m l容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別取進(jìn)樣10μl測(cè)定。以進(jìn)樣量（x）對(duì)峰面積（y）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其回歸方程為y＝162769x＋395085，r＝0.9998（n＝6）。表明槲皮素在0.04～0.4μg／ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 分別配制高、低2種濃度的槲皮素對(duì)照品各5份，分別測(cè)定，測(cè)定槲皮素峰面積，結(jié)果RSD值分別為0.71%和0.53%。說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫密閉放置，分別于0、2、4、6、8h進(jìn)樣10μl，測(cè)定槲皮素的峰面積，RSD為0.87%（n＝5），說(shuō)明樣品在8h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，按“2.2”的方法制成供試品溶液，測(cè)定槲皮素的平均峰面積，RSD為0.72%（n＝5）。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取槲皮素對(duì)照品6mg，加入到10g乳膏劑基質(zhì)中，充分研磨均勻，再精密稱取該樣品1g，溶于50ml80%甲醇中，置于80℃水浴中保持10min，并不停震蕩，濾過(guò)，取續(xù)濾液10μl注入液相色譜儀，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.8 樣品測(cè)定 取3批百癬夏塔熱軟膏按“2.2”的方法制成供試品溶液，測(cè)得3批樣品中槲皮素的含量，結(jié)果見表2。

3 沒食子酸的含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100－5 C18 column（250mm×4.6mm）；流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸溶液（10：90）；柱溫：25℃；流速：1ml／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm。

3.2 供試品溶液的制備取百癬夏塔熱軟膏約1g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取沒食子酸對(duì)照品5mg，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液1、2、4、6、8、10ml移至50ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10μl測(cè)定。以進(jìn)樣量（x）對(duì)峰面積（y）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其回歸方程為y＝15128x＋478660，r＝0.9996（n＝6）。表明沒食子酸在0.02～0.2μg／m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 分別配制高、低2種濃度的槲皮素對(duì)照品各5份，分別測(cè)定，測(cè)定沒食子酸的峰面積，結(jié)果RSD值分別為0.52%和0.47%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫密閉放置，分別于0、2、4、6、8h進(jìn)樣10μl，測(cè)定沒食子酸的峰面積，RSD為0.59%（n＝5），說(shuō)明樣品在8h內(nèi)較為穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，按“3.2”的方法制成供試品溶液，測(cè)得沒食子酸的峰面積，RSD為0.93%（n＝5）。

3.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品5mg，加入到10g適量乳膏劑基質(zhì)中，充分研磨均勻；再精密稱取該樣品1g，精密加入50m l 50%甲醇，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10μl注入液相色譜儀，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

3.8 樣品測(cè)定 取3批百癬夏塔熱軟膏按3.2的方法制成供試品溶液，測(cè)得3批樣品中沒食子酸的含量，結(jié)果見表3。

4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

4.1 高濕度實(shí)驗(yàn) 取本品適量（約5g），置于平皿中，在25℃、相對(duì)濕度75%條件下敞口放置10天，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)并與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)樣品進(jìn)行比較，未見明顯變化。結(jié)果見表6。

4.2 強(qiáng)光照射實(shí)驗(yàn) 取本品適量，置于平皿中，在4000Lx光照度下照射10d。在此期間，分別于0、1、3、5、10d取樣檢驗(yàn)，除軟膏有硬化現(xiàn)象且色澤加深外，含量無(wú)明顯變化。結(jié)果見表4。

4.3 高溫高濕加速實(shí)驗(yàn) 取本品適量，裝入固體藥用高密度聚乙烯瓶加蓋密閉保存，在溫度（40±2）℃，濕度（75± 5）%下放置6個(gè)月，分別于0、1、2、3、6個(gè)月末取樣［2］，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果見表5。

4.4 低溫實(shí)驗(yàn) 取本品適量，裝入固體藥用高密度聚乙烯瓶加蓋密閉保存，于（－15±1）℃放置24h，取出后至室溫時(shí)測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)并與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的樣品比較，均無(wú)明顯變化，結(jié)果見表6。

5 討論

地錦草為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd.或斑地錦Euphorbiamaculata L.的干燥全草，具清熱解毒，涼血止血，利濕退黃的功效。研究表明，地錦草含有黃酮、三萜、甾醇、香豆素、鞣質(zhì)及酚酸類等化合物［3］，對(duì)金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、乙型鏈球菌均有明顯抑制作用，對(duì)甲型鏈球菌亦有抑菌作用［4］。因此，實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定其主要成分槲皮素的含量。另外，訶子、毛訶子肉、西青果等都含有沒食子酸［5－7］，因此以沒食子酸作為控制西青果、訶子等藥材的限量。由于蘆薈苷不穩(wěn)定，容易受到各種因素的影響而發(fā)生轉(zhuǎn)化，方中蘆薈的定量還待進(jìn)一步研究。

文獻(xiàn)［8－9］分別測(cè)定了百癬夏塔熱膠囊中沒食子酸的含量和百癬夏塔熱片中槲皮素的含量，本文采用高效液相色譜法測(cè)定了百癬夏塔熱軟膏中的槲皮素及沒食子酸的含量，建立的方法穩(wěn)定、可靠、易操作，為百癬夏塔熱軟膏質(zhì)量控制奠定了一定的研究基礎(chǔ)。同時(shí)，該軟膏的穩(wěn)定性考察表明，百癬夏塔熱軟膏在高濕、低溫條件下外觀未改變，槲皮素及沒食子酸的含量穩(wěn)定；該制劑在生產(chǎn)加工時(shí)不宜長(zhǎng)時(shí)間暴露于強(qiáng)光下；不宜在高溫下長(zhǎng)期存放。因此，在生產(chǎn)、存儲(chǔ)時(shí)為避免藥物性狀發(fā)生改變，應(yīng)注意不宜長(zhǎng)時(shí)間暴露在強(qiáng)光下，包裝應(yīng)嚴(yán)密。而長(zhǎng)期穩(wěn)定性還需進(jìn)一步研究。

［1］李雪君，瑪依努，王瑞芳，等.百癬夏塔熱軟膏的工藝研究［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2013，10（8）：240.

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R284.1

A

1007－8517（2015）16－0026－02

2015.05.15）