杜銀忠　沈曉英　文 英　安林昌

（青海大學(xué)，青海西寧　810016）

青海省東部農(nóng)區(qū)仔豬致病性大腸桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)

杜銀忠沈曉英文 英安林昌

（青海大學(xué)，青海西寧810016）

用NCCLS（National committee for clinical laboratory standards）法選用14種抗生素對(duì)青海省互助、湟源、平安、大通、西寧、湟中等東部農(nóng)業(yè)區(qū)地區(qū)仔豬致病性大腸桿菌進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，14種抗生素中抑菌作用最強(qiáng)的為諾氟沙星，其敏感菌株占（97/152）63.8%，其次，為氧氟沙星（96/152）63.2%，慶大霉素（92/152）60.5%；耐藥菌株較多且表現(xiàn)為多重耐藥。

仔豬致病性大腸桿菌耐藥性

仔豬大腸桿菌病是由豬源致病性大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）感染引起的傳染病，是獸醫(yī)臨床上常見(jiàn)的疾病之一，為控制大腸桿菌病的發(fā)生，臨床上抗菌藥的使用非常廣泛而頻繁，甚至有濫用的跡象，大腸桿菌的耐藥率已大幅度上升，多重耐藥菌株劇增，耐藥譜增寬［1］，盲目使用抗生素帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)越來(lái)越突出，為此，采用NCCLS標(biāo)準(zhǔn)化法規(guī)對(duì)分離自青海省互助、湟源、平安、大通、西寧等地豬場(chǎng)仔豬致病性大腸桿菌進(jìn)行了耐藥性檢測(cè)，以期篩選出適合于該地區(qū)或豬場(chǎng)使用的敏感藥物，指導(dǎo)臨床用藥，對(duì)地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)防治仔豬大腸桿菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病料的采集

從青海省互助、湟源、平安、大通、西寧、湟中等地區(qū)豬場(chǎng)采集仔豬腹瀉糞樣，共計(jì)265份。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑

普通瓊脂培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基、EMB瓊脂、酵母膏、營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；MH培養(yǎng)基，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；生化微量發(fā)酵管，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小白鼠18～24 g昆明系小白鼠，購(gòu)自青海省地方病研究所。

1.1.4藥敏紙片

NCCLS規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，抗生素種類(lèi)為：頭孢拉定（VI）、氯霉素（氯）、妥布霉素（妥）、慶大霉素（慶）、環(huán)丙沙星（環(huán)）、氧氟沙星（奧）、克林霉素（潔C）、頭孢唑林（V）、阿莫西林（阿）、卡那霉素（卡）、諾氟沙星（氟）、麥迪霉素（麥）、萬(wàn)古霉素（萬(wàn)）、氨芐西林（氨）等14種藥敏紙片（WS/T125-1999）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病料的采集

采集時(shí)先將棉簽用無(wú)菌生理鹽水蘸濕，再用棉簽取腹瀉仔豬的糞便裝入滅菌試管并標(biāo)記。

1.2.2大腸桿菌的分離純化

將所采集的265份仔豬的糞樣先用0.9%的生理鹽水稀釋、搖勻后用滅菌的接種環(huán)勾取1～2環(huán)接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃培養(yǎng)18～24 h，再?gòu)臓I(yíng)養(yǎng)肉湯中勾取1～2環(huán)接種到EMB培養(yǎng)基上37 ℃18～24 h后挑取疑似單個(gè)菌落（紫黑色帶金屬光澤）進(jìn)行革蘭染色，鏡檢，將培養(yǎng)特性及形態(tài)、染色反應(yīng)、排列均符合大腸桿菌的菌株畫(huà)線(xiàn)接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板純化后進(jìn)行生化鑒定。

1.2.3大腸桿菌的生化試驗(yàn)

將純化好的細(xì)菌分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、M-R、V-P、靛基質(zhì)、硝酸鹽、尿素、硫化氫、枸櫞酸鹽、半固體瓊脂等生化發(fā)酵管，三糖鐵培養(yǎng)基（TSI）。37 ℃24～48 h，觀(guān)察結(jié)果。

1.2.4大腸桿菌致病性實(shí)驗(yàn)

生化試驗(yàn)符合大腸桿菌的菌株接種普通肉湯，37℃培養(yǎng)18h，分別腹腔接種小白鼠，0.2ml/只，觀(guān)察存活情況，死亡的小白鼠經(jīng)剖檢取其臟器后，用EMB平板進(jìn)行接種菌回收實(shí)驗(yàn)，其培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)均符合大腸桿菌的菌株定為致病性大腸桿菌。

1.2.5藥敏試驗(yàn)

取致病性大腸桿菌MH純培養(yǎng)物，分別用滅菌生理鹽水洗下稀釋并與麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，選取5×108個(gè)/ml濃度，15 min內(nèi)用無(wú)菌棉試紙蘸取已校正的菌液，涂布在4 mm厚MH平板表面，每塊平板涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)60°，均勻接種，干燥平板3～5 min后，分別貼上各種藥敏紙片，每塊平板貼3片，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀(guān)察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）藥敏紙片擴(kuò)散法規(guī)與文獻(xiàn)［2-5］。

2　結(jié)果

2.1致病性大腸桿菌分離的情況

從265份糞樣中共分離鑒定出致病性大腸桿菌152株。

2.2藥敏試驗(yàn)

14種抗生素中抑菌作用最強(qiáng)的為諾氟沙星，其敏感菌株占（97/152）63.8%，其次為氧氟沙星（96/152）63.2%、慶大霉素（92/152）60.5%、環(huán)丙沙星（90/152）59.2%、頭孢唑啉（79/152）52.0%、妥布霉素（78/152）51.3%、氯霉素（73/152）48.0%。152株菌株對(duì)抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中2重耐藥13株（13/152，8.6%），3重耐藥16株（16/152，10.5%），4重耐藥13株（13/152，8.6%），5重耐藥16株（16/152，10.5%），6重耐藥10株（10/152，6.6%），7重耐藥9株（9/152，5.9%），8重耐藥12株（12/152，7.9%），9重耐藥11株（11/152，7.2%），10重耐藥5株（5/152，3.3%），11重耐藥17株（17/152，11.2%），12重耐藥8株（8/152，5.3%），13重耐藥4株（4/152，2.6%），14重耐藥7株（7/152，4.6%）。

3　討論

（1）152株分離自青海省互助、湟源、平安、大通、西寧、湟中等地區(qū)的仔豬致病性大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果表明對(duì)諾氟沙星敏感菌株較多，占（97/152）63.8%，而對(duì)大部分常用抗生素表現(xiàn)為耐藥，如在耐藥菌株中，耐麥迪霉素（122/152）80.3%、耐克林霉素（109/152）71.7%、耐阿莫西林（105/152）69.1%、耐萬(wàn)古霉素（98/152）64.5%、耐氨芐西林（96/152）63.2%。在一定時(shí)間內(nèi)，此結(jié)果對(duì)本地區(qū)豬場(chǎng)防治致病性大（2）152株菌株對(duì)14種藥物均有不同程度的耐藥性，且表現(xiàn)為多重耐藥，2～6重耐藥菌株占44.7%，7～10重耐藥菌株占24.3%，11重耐藥17株占11.2%，12重耐藥8株占5.3%，13重耐藥4株占2.6%，對(duì)所選抗生素全部耐藥菌株7株占4.6%，有如此高的耐藥比例及眾多多重耐藥菌株，獸醫(yī)工作者應(yīng)引起足夠的重視。

腸桿菌病提供了科學(xué)的用藥依據(jù)。本次試驗(yàn)結(jié)果與四川、重慶等地大腸桿菌耐藥性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果［6，7］比較，敏感菌株比例降低，耐藥菌株比例增多。

（3）規(guī)?；i場(chǎng)由于疾病的壓力而大量使用抗生素，而細(xì)菌的耐藥性通過(guò)染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)在細(xì)菌間傳播和擴(kuò)散，應(yīng)定期對(duì)本豬場(chǎng)分離菌株進(jìn)行抗生素敏感性的監(jiān)測(cè)，以指導(dǎo)臨床用藥。

［1］ 朱力軍.動(dòng)物大腸桿菌耐藥性的變化趨勢(shì)［J］.中國(guó)獸藥雜志，2001，35（2）：16-18.

［2］ 王輝，陳民鈞，徐英春，等.簡(jiǎn)要介紹美國(guó)NCCLS藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法法規(guī)（續(xù)）［J］.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1995，18（2）：118-124.

［3］ 呂繩凱，葛平.1998年美國(guó)NCCLS紙片法藥敏試驗(yàn)法規(guī)中主要變動(dòng)［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1999，14（1）：53

［4］ 呂繩凱，葛平，陳蓉.2001年NCCLS藥敏標(biāo)準(zhǔn)中的主要變動(dòng)［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2001，16（3）：184-185.

［5］ 孫長(zhǎng)貴，曾賢銘，成軍.2005年CLSI/NCCLS文件M100-S15主要更新內(nèi)容介紹［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2005，23（5）：382-386.

［6］ 賴(lài)婧，劉洋，汪宇，等.800株不同動(dòng)物源大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)［J］.獸醫(yī)研究，2013，185：50-52.

［7］ 李剛.鄒平地區(qū)鴨源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測(cè)［D］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

青海省農(nóng)牧廳獸醫(yī)局科技項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)NMSY-2013-04

杜銀忠（1970-），男，教授，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)工作。