王玲玲，劉永杰，鄭海學，張克山，劉湘濤

羊傳染性膿皰病毒抗干擾素基因(VIR)研究進展

王玲玲，劉永杰，鄭海學，張克山，劉湘濤

羊傳染性膿皰病毒(ORFV)是痘病毒科副痘病毒屬的成員之一，引起嚴重的人獸共患傳染病。該病毒基因組全長約134～139 kb，編碼130多個蛋白，抗干擾素基因是ORFV編碼的具有拮抗宿主干擾素功能的蛋白，在ORFV突破宿主免疫屏障過程中有重要作用。本文就抗干擾素基因的研究進展作一綜述。

羊傳染性膿皰病毒；VIR基因；研究進展

羊傳染性膿皰(俗稱羊口瘡)是由羊傳染性膿皰病毒(Orf virus，ORFV)感染引起的嚴重的人獸共患傳染病。ORFV含線性雙股DNA，有囊膜，屬于痘病毒科(Poxviridae)，副痘病毒屬(Parapoxvirus)，可感染山羊、綿羊，也可以感染人，通常是急性感染，引起口唇、舌、鼻、乳房等部位皮膚與黏膜形成水皰、丘疹、膿皰、潰瘍，然后結(jié)成疣狀痂[1]。ORFV具有嗜上皮性，皮膚破損處容易感染并在上皮細胞中增殖。該病為自限性感染，通?；疾游?～2個月就會康復[2]?；疾游镆话闼劳雎什桓撸绻嵫蚋腥竞笥掷^發(fā)感染或混合感染其他病毒或細菌則死亡率較高，人感染后主要表現(xiàn)為指間、手背以及手臂出現(xiàn)皰疹和破潰[3-4]。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，我國湖北、山東、貴州、福建、黑龍江、新疆等多個省份均有該病發(fā)生，不僅給養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，還嚴重威脅人民的身體健康。

ORFV基因組為線性雙股DNA，全長約為134～139 kb，不同毒株之間基因組長度有10～25 kb的差異?；蚪M共有16個開放閱讀框，編碼大約130個基因[5]。許多痘病毒基因組富含AT，而ORFV等副痘病毒屬的一些病毒則G+C含量較高，約64%[6]。ORFV基因組中間有一個較長的中心編碼區(qū)，主要編碼一些與病毒復制和裝配或病毒形態(tài)有關(guān)的蛋白，如RNA聚合酶等。中心編碼區(qū)以外兩端編碼一些病毒復制非必需基因，如抗干擾素基因(VIR)，IL-10基因(vIL-10)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，趨化因子結(jié)合蛋白(CBP)，錨蛋白(ANK)，脫氧尿苷焦磷酸酶 (dUTPase) ，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)抑制因子(GIF)，這些基因與ORFV宿主嗜性、致病力及免疫逃避有關(guān)[7-9]?；蚪M兩端各有3 kb左右的反向末端重復序列(inverted terminal repeat，ITR)，兩端有封閉的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。ORFV基因組相對保守，不同毒株之間同源性較高，但兩端非保守區(qū)頻繁突變，同一物種的不同毒株也有較高的變異率[10]，ORFV細胞培養(yǎng)時連續(xù)傳代常發(fā)現(xiàn)ITRs有基因重排現(xiàn)象，這種基因重排和缺失會導致病毒毒力改變[11]。

VIR是ORFV感染早期表達的主要毒力因子之一，參與拮抗宿主免疫應答，能在早期感染時為病毒的復制和增殖創(chuàng)造有利條件[12]。本文就ORFV編碼的VIR的結(jié)構(gòu)和功能等方面進行綜述，以期闡明VIR的研究現(xiàn)狀。

1 VIR的結(jié)構(gòu)與特征

VIR基因位于ORFV基因組左側(cè)距離左端20 kb的位置，VIR基因比較保守，常用作比較不同毒株間的親緣關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13-14]。在VIR基因起始密碼子上游有痘病毒保守的啟動子以及轉(zhuǎn)錄控制元件，并在TAA終止密碼子之后有一個痘病毒保守的早期基因轉(zhuǎn)錄終止序列T5NT。抑制病毒中晚期表達后，VIR基因仍然表達證實了該基因在感染早期表達[14]。VIR基因與牛痘病毒(Vaccine virus, VACV)的抗干擾素基因E3L同源，二者核苷酸序列一致性為44%，其產(chǎn)物的氨基酸序列有31%的一致性，相似性為53%[15-16]。VACV的E3L蛋白C端結(jié)構(gòu)域為ds-RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是VACV抗干擾素活性以及細胞培養(yǎng)時適應廣闊的宿主范圍所必需的[17-18]，N端為Z-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與E3L蛋白核定位有關(guān)，兩個結(jié)構(gòu)域由一段酸性、胰蛋白酶敏感的序列連接起來[19]，兩個結(jié)構(gòu)域均為該基因致病所必需的[20]。結(jié)構(gòu)域預測表明VIR蛋白也是由N端的Z-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端的ds-RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。

2 VIR編碼兩種蛋白

VIR基因在宿主細胞內(nèi)以及構(gòu)建的載體均能夠表達出兩種蛋白質(zhì)VIR以及shVIR，大小分別約為25 kDa和12 kDa[21]。后者的出現(xiàn)是因為mRNA進行翻譯時，將起始密碼子下游的甲硫氨酸密碼子作為了起始密碼子，跳過了多肽鏈氨基端的一部分序列。將下游的AUG密碼子替換為AUU則不能產(chǎn)生shVIR。VIR與shVIR的許多特性比較相似，都可以結(jié)合dsRNA，抑制PKR活性，抑制干擾素免疫應答等。二者在細胞中的分布不同， shVIR由于缺少核定位序列，主要分布在細胞質(zhì)中 ，而VIR主要分布在細胞核中。并且在小鼠模型中，只表達shVIR的重組ORFV毒力相對較弱，說明VIR的N端結(jié)構(gòu)域與該基因的致病性有關(guān)[22]。

3 VIR抑制宿主干擾素應答

ORFV在細胞培養(yǎng)時表現(xiàn)出拮抗干擾素的活性，并且能夠保護其他病毒在含有I型和II型干擾素的培養(yǎng)液中增殖，ORFV的這一活性與VIR基因有關(guān)。將VIR基因的表達產(chǎn)物加入細胞上清能保護病毒在含IFN的培養(yǎng)液中增殖。病毒復制過程中產(chǎn)生的dsRNAs是誘導抗病毒免疫應答中重要的病原相關(guān)分子模式(PAMP)，蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)是干擾素信號通路下游重要的蛋白質(zhì)[23-24]。VIR蛋白結(jié)合dsRNA以及PKR的特性在ORFV抑制干擾素應答中發(fā)揮重要作用。

3.1 雙鏈RNA結(jié)合活性 Haig等用大腸桿菌表達的VIR融合蛋白進行電泳遷移率實驗證實VIR蛋白的dsRNA結(jié)合活性[25]。許多ds-RNA結(jié)合蛋白有5個保守的氨基酸殘基F148, S166, K167, R168, K171，是結(jié)合dsRNA所必需的。這5個氨基酸殘基形成一個親水的平面作用于dsRNA的小溝[26-27]。VIR蛋白的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域也存在這5個保守殘基。VIR蛋白相比牛痘病毒E3L蛋白有3個突變，E3L中的Q127, P142和 A175，在VIR中對應的是 M119, E135, 和 C168，這3個突變改變了VIR蛋白dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域疏水中心的穩(wěn)定性，使VIR結(jié)合dsRNA的能力相對其他的dsRNA結(jié)合蛋白減弱[21]。

3.2 抑制PKR活性 VIR能夠抑制PKR活性，抑制PKR的自身磷酸化以及對翻譯起始因子eIF-2α亞基的磷酸化。正常情況下，PKR在干擾素的誘導作用下，與病毒dsRNA結(jié)合后發(fā)生自我磷酸化，并使翻譯起始因子eIF-2的α鏈磷酸化。磷酸化的eIF-2不能發(fā)揮其正常作用，病毒蛋白以及細胞中的蛋白質(zhì)無法合成，從而阻止病毒復制[28]。PKR還與細胞凋亡有關(guān)，VIR蛋白抑制PKR活性從而使病毒得以在細胞內(nèi)復制[29]。由于PKR具有dsRNA依賴性，VIR基因的產(chǎn)物具有結(jié)合dsRNA的活性，能夠與PKR競爭性結(jié)合dsRNA，VIR抑制PKR活性曾被認為是該蛋白結(jié)合dsRNA從而阻斷了PKR的激活導致的[30]。Yeu-yang Tseng等通過免疫共沉淀的方法證明了VIR以及shVIR均能夠直接與PKR結(jié)合抑制其功能的發(fā)揮[22]。

4 VIR可取代VACV的E3L基因發(fā)揮作用

ORFV的VIR與同源的VACV蛋白E3L的氨基酸序列相似性只有53%，有研究將VIR基因與缺失E3L基因的VACV重組，VIR基因插入在E3L基因的位置，VIR基因能夠替代E3L的作用，重組病毒能夠抑制干擾素，適應原來的宿主范圍，與野生型的VACV一樣復制增殖，但重組病毒的毒力相比野生型減弱，使重組病毒毒力減弱的原因主要是C端結(jié)構(gòu)域的改變[21]。VACV可以用作重組疫苗的載體以及抗癌治療[31-32]，插入VIR基因構(gòu)建的重組病毒，在組織細胞培養(yǎng)時能夠有效增殖且毒力相對較弱，有潛力發(fā)展成為新一代的重組疫苗載體。

5 展 望

病毒復制過程中產(chǎn)生的dsRNAs是誘導宿主抗病毒免疫應答中重要的病原相關(guān)分子模式(PAMP)。許多病毒抵抗宿主抗病毒免疫的方式便是產(chǎn)生dsRNA結(jié)合蛋白，如痘病毒的E3蛋白家族、流感病毒的NS1以及埃博拉病毒的V35蛋白[33-34]。結(jié)合并阻斷病毒的dsRNA PAMP從而抑制相關(guān)的抗病毒免疫應答是目前發(fā)現(xiàn)的許多病毒dsRNA結(jié)合蛋白的作用方式。VIR編碼的蛋白質(zhì)通過結(jié)合并阻斷病毒的dsRNA PAMP，結(jié)合并抑制干擾素信號通路中的PKR激酶，作為ORFV逃避宿主免疫的重要部分，為病毒在宿主細胞內(nèi)復制贏得時機。進一步深入研究VIR的功能，對于全面認識ORFV的致病及免疫逃避的分子機制有重要作用。

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Progress on virus interferon resistance gene encoded by Orf virus

WANG Ling-ling,LIU Yong-jie,ZHENG Hai-xue,ZHANG Ke-shan,LIU Xiang-tao

(LanzhouVeterinaryResearchInstituteofChineseAcademyofAgricultureScience,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,NationalFoot-and-MouthDiseaseReferenceLaboratory,Lanzhou730046,China)

Orf virus (ORFV) is one of the prototype species of theParapoxvirusgenus of thePoxviridaefamily and causes serious zoonotic infectious disease. The genome of ORFV ranges in size from 134 kb to 139 kb, containing about 130 genes. VIR encoded by ORFV is a protein involved in interferon resistance and plays an important role in the progress of ORFV breakthrough host immune barrier. This paper reviewed the status and research progress of VIR.

orf virus; VIR gene; research progress

s: Zhang Ke-shan, Email: zks009@126.com,Liu Xiang-tao, Email: hnxiangtao@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.019

國家自然科學基金(No.NSFC-31201914)，中國博士后科學基金(No.2013M530683)和 國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(No.CARS-39)聯(lián)合資助

張克山,Email：zks009@126.com; 劉湘濤,Email: hnxiangtao@hotmail.com

中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046

S852.65

A

1002-2694(2015)12-1181-04

2015-04-01；

2015-07-27

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31201914), the China Post Doctoral Science Foundation(No. 2013M530683), and the China Agriculture Research System(No. CARS-39)