劉志國(guó)，王 妙，崔步云，劉日宏，夏咸柱

布魯氏菌基因組學(xué)研究進(jìn)展

劉志國(guó)1,2,3，王 妙3，崔步云4，劉日宏3，夏咸柱5

布魯氏菌是一類革蘭氏陰性、胞內(nèi)寄生菌，缺乏經(jīng)典的毒力因子，致病性不僅依靠侵襲力和內(nèi)毒素，還有賴于較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。目前，布魯氏菌入侵機(jī)體和在胞內(nèi)持續(xù)存在的機(jī)制尚未明確。布魯氏菌基因組學(xué)研究不僅可全面了解布魯氏菌的基因組成、分子進(jìn)化、毒力因子以及致病機(jī)制等特點(diǎn)，還可以對(duì)一些致病相關(guān)基因和重要的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。該研究為開(kāi)發(fā)研究疫苗和新型抗生素提供分子基礎(chǔ)，從而為構(gòu)建新的有效的布病治療和防控策略提供理論依據(jù)。本文就布魯氏菌的基因組組成、特征，全基因組測(cè)序分析、比較基因組研究進(jìn)展予以概述。

布魯氏菌；基因組；比較基因組學(xué)；進(jìn)化基因組學(xué)

布魯氏菌是一類重要的人獸共患病病原菌，不僅對(duì)人和多種動(dòng)物致病，亦是一種潛在的生物武器[1]。目前，布魯氏菌的致病機(jī)制、毒力基因以及在胞內(nèi)持續(xù)存在的機(jī)制尚不完全明確，致使安全有效疫苗和藥物的研發(fā)處于停滯。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已有許多布魯氏菌被測(cè)序分析，通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，不僅同一個(gè)種內(nèi)部不同菌株之間基因組有較大的差異,有SNP缺失和插入，還有基因數(shù)目的差異；還發(fā)現(xiàn)同一種內(nèi)不同菌株之間基因差異與基因水平轉(zhuǎn)移有關(guān)，也就是說(shuō)某個(gè)菌株的獨(dú)有基因很可能是從別的細(xì)菌中水平轉(zhuǎn)移而來(lái)，這樣就造成了種內(nèi)基因多樣性，而這些差異基因大多都和一些特殊的表型有關(guān)，比如耐藥、毒力等。因此，全基因組學(xué)研究不僅可以進(jìn)行種內(nèi)、種間的進(jìn)化關(guān)系研究，還可以闡明分子致病機(jī)制，篩選、鑒定致病相關(guān)基因，為開(kāi)發(fā)研究疫苗、新型抗生素提供新的策略。

1 布魯氏菌基因組構(gòu)成

布魯氏菌屬在分類上屬根瘤菌目、布魯氏菌科，各生物型的G+C含量為55%～59%，DNA高度同源，同源性均在90%以上，基因組大小和組成異常相似[2]，除B.suis 3型菌的基因組僅含1條大小為3.2 Mb染色體外，其余布魯氏菌的基因組均由2條獨(dú)立且完整的環(huán)狀DNA染色體組成，大小分別為2.1 Mb和1.2 Mb。在2.1 Mb的大染色體上含有1個(gè)復(fù)制起始區(qū)，1.2 Mb的小染色體上含有1個(gè)質(zhì)粒復(fù)制功能區(qū)[3]。通常編碼3 200～3 500個(gè)開(kāi)放閱讀框[4]。

2 布魯氏菌基因組特征

布魯氏菌的基因組中無(wú)質(zhì)粒、無(wú)溫和噬菌體，有插入序列(IS)，但各個(gè)種型的拷貝數(shù)不同，從7個(gè)拷貝到30個(gè)拷貝不等。此外，還有較短的重復(fù)回文序列存在，而短重復(fù)回文序列、單核苷酸多態(tài)性、插入序列則是布魯氏菌基因組多態(tài)性的主要來(lái)源。另外，布魯氏菌基因組中還存在假基因，不同菌株中假基因的數(shù)量差別很大,田鼠型布魯氏菌假基因最少，僅有63個(gè)；而牛種布魯氏菌2 308則多達(dá)316個(gè),假基因的積累反映了菌株的適應(yīng)性進(jìn)化。布魯氏菌屬的基因組成、特征基本相似，但各個(gè)種型之間稍有差別，而細(xì)微的差異使他們的致病性、毒力、環(huán)境適應(yīng)性等各不相同，而這些細(xì)微的差異或許正是致病性和毒力差異的所在，系今后研究的立足點(diǎn)。

2.1 主要致病布魯氏菌全基因組測(cè)序分析 全基因組測(cè)序分析不僅可用于基因遺傳特性分析，還是一種強(qiáng)有力的基因分析工具，在鑒別和篩選布魯氏菌差異基因、致病基因中具有重要的作用。牛種菌A13334的全基因組為3.3 Mb，由2條染色體組成,長(zhǎng)度分別為2.1 Mb(ChrI)和1.2 Mb(ChrII)；G+C含量均為 57%；約有3 338個(gè)編碼基因，其中2 182個(gè)位于染色體1，另1 153個(gè)位于染色體2；2條染色體約85%～87%的基因可以編碼蛋白；基因組中有55個(gè)tRNA 基因 (其中41個(gè)位于1號(hào)染色體，14個(gè)位于2號(hào)染色體) 和 9個(gè) rRNA基因(其中6 位于1號(hào)染色體，3個(gè)位于2號(hào)染色體)[5]。羊種布氏菌 ADMAS-G1的基因組全長(zhǎng)為3.3 Mb，G+C含量為57.3%，編碼3 388個(gè)基因，其中3 325個(gè)是蛋白編碼基因，2 610個(gè)為功能蛋白、715為假設(shè)蛋白。預(yù)測(cè)有RNA 基因63個(gè)，包括 57個(gè)tRNA 和6個(gè)rRNA 基因。58個(gè)基因與致病機(jī)制有關(guān)，virBIII型,IV和V分泌路徑以及獨(dú)立蛋白組件TatC分泌應(yīng)答等相關(guān)路徑；另有44個(gè)防御機(jī)制基因，其中包括負(fù)責(zé) ABC 型藥運(yùn)輸系統(tǒng)、多藥耐外排泵、限制性內(nèi)切酶等基因[6]。羊種布魯氏菌BmIND1的基因組有3 284 360個(gè)堿基，有3 360個(gè)蛋白編碼基因，G+C含量為57.2%，包含49個(gè)tRNA、3個(gè)rRNA和964個(gè)直系同源基因(KEGG)。另外，研究還發(fā)現(xiàn)有58個(gè)基因具有分泌功能并可能參與宿主-病原體相互作用[7]。多個(gè)致病布魯氏菌株的全基因組測(cè)序分析極大的豐富布魯氏菌基因組信息，對(duì)篩選和識(shí)別布魯氏菌致病基因及毒力島有重要的意義。

2.2 非主要致病布魯氏菌的全基因組測(cè)序分析 目前，絕大多數(shù)的布病由羊種菌和牛種菌引起，而豬種菌、犬種菌等非主要致病菌的全基因組測(cè)序分析有助于了解布魯氏菌的進(jìn)化、變異以及致病差異等相關(guān)信息。犬種布魯氏菌SVA13的基因組G+C含量為57.24%，2條環(huán)狀染色體分別為2.1 Mb和1.2 Mb。全基因組包含3 093個(gè)基因，其中2 950個(gè)為編碼基因，有5S、16S和23S RNA 3種核糖體，16個(gè)操縱子、1個(gè)非編碼基因、55個(gè)tRNA 操縱子。在基因組中有57個(gè)移碼突變。1號(hào)染色體包含60個(gè)長(zhǎng)度>8個(gè)堿基的重復(fù)串聯(lián)序列，2號(hào)染色體中有30個(gè)長(zhǎng)度為2～264個(gè)堿基拷貝數(shù)為2～11的串聯(lián)重復(fù)序列[8]?；蛐蜑镾T26型的鯨魚型布氏菌TE10759-12的基因組G+C含量為57%,基因組由2條染色體組成，分別為2.1 Mb和1.2 Mb。另外，有9個(gè)完整的rRNA，44 個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子和2 611個(gè)編碼基因[9]。在豬種4型菌NCTC10385、鯨魚型菌NCTC12891T、B.inopinatastrain CAMP 6436T和沙林鼠種ATCC23459T的基因組內(nèi)均檢測(cè)到了串聯(lián)重復(fù)序列，其中豬種4型菌有84個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，最大出現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)為4，而鯨魚型、沙林鼠種和B.inopinata的串聯(lián)重復(fù)序列分別為55,49和63個(gè)，串聯(lián)重復(fù)頻率分別為7、10和7[10]?；蚪M序列中的插入/缺失事件可能在不同宿主偏好性上有一定影響，進(jìn)而與其致病性有一定的關(guān)聯(lián)。非主要致病性布魯氏菌與牛羊布魯氏菌的全基因組特征幾乎相似，而致病性卻相差甚遠(yuǎn)，作者認(rèn)為篩選兩者之間的差異基因或非編碼基因是解開(kāi)致病性差異的候選方法，而布魯氏菌基因組測(cè)序是揭開(kāi)布魯氏菌之謎的絕佳路徑。

3 布魯氏菌野毒株比較基因組學(xué)

比較基因組學(xué)不僅可以進(jìn)行全基因組的比較和系統(tǒng)發(fā)生的進(jìn)化關(guān)系分析，還可進(jìn)行細(xì)菌基因組多態(tài)性的研究，從而揭示基因潛在的功能、闡明物種進(jìn)化關(guān)系及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)[11]。牛種野毒株9-941、豬種1 330和羊種16 M的比較基因組學(xué)研究表明，它們的基因組十分相似，基因含量和基因組成幾乎相同，99%以上的氨基酸序列相同，基因組的開(kāi)放閱讀框個(gè)數(shù)也極為相近，它們的主要區(qū)別來(lái)自于sORFs和大的插入刪除，該發(fā)現(xiàn)為確定布魯氏菌的致病性和毒力表型提供了重要依據(jù)[12]。1株ST8型羊種菌的比較基因組學(xué)研究結(jié)果顯示，該菌株共有182處小的缺失和102處插入，并預(yù)測(cè)有2 836個(gè)單核苷酸多態(tài)性[13]。對(duì)羊種強(qiáng)毒株M28-12和羊種疫苗株M5、M111以及豬種菌S2的比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)M5、M28-12和 M111共有1 370個(gè)單核苷酸多態(tài)性，其中89個(gè)來(lái)自 M5和M111以及M28-12，61個(gè)來(lái)自豬種1330和豬種菌S2，并指出這些多核苷酸多肽性位點(diǎn)可能來(lái)自于疫苗株的突變，對(duì)設(shè)計(jì)新的更加安全的疫苗具有重要的啟示[14]。牛種菌BCB027與牛種菌強(qiáng)毒株相比，基因組中有137個(gè)小的缺失，其中有34個(gè)位于編碼區(qū)；有3 507個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中2 731個(gè)位于編碼區(qū)，表明從非主要宿主體分離的菌株在遺傳方面有較大的改變[15]。牛種菌A13334與牛種9-941和Rb51相比有48個(gè)特有基因；與104M基因組高度相似，但毒力差異較大，差異可能系由某些基因片段的丟失和水平轉(zhuǎn)移有關(guān)。A13334基因組特有的37個(gè)基因中絕大多數(shù)基因編碼涉及維持生命周期的多種酶類，其余則直接或間接的與毒力相關(guān)，而這些基因的丟失可能是104M毒力衰減的原因之一[16]。布魯氏菌的比較基因組學(xué)研究加快了新的功能基因和主要致病差異基因的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)而為研究布魯氏菌致病等相關(guān)機(jī)制提供了參考。

4 布魯氏菌疫苗株S19比較基因組學(xué)

為了揭開(kāi)S19是有何種遺傳特性使得其可以作為疫苗保護(hù)牛群以及強(qiáng)毒株導(dǎo)致流產(chǎn)的秘密，研究者對(duì)S19進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并通過(guò)對(duì)新獲得的S19基因組信息和牛種菌9-941以及2 308的基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有24個(gè)基因與布魯氏菌的毒力相關(guān)，其中有4個(gè)基因與毒力直接關(guān)聯(lián)，這4個(gè)獨(dú)立關(guān)聯(lián)基因在強(qiáng)毒株中編碼外膜蛋白、三赤蘚糖醇的吸收或代謝相關(guān)蛋白質(zhì)基因。該研究不僅將對(duì)了解布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝機(jī)制的特點(diǎn)有極大的幫助，也為闡明S19作為疫苗候選株具有良好的免疫保護(hù)和證實(shí)其他菌株具有致病性提供了佐證[17]。布魯氏菌比較基因組學(xué)已經(jīng)成為研究布魯氏菌基因組的有力方法，在布魯氏菌篩選毒力基因、預(yù)測(cè)重要基因和蛋白方面發(fā)揮了重要作用。然而，作者認(rèn)為傳染病實(shí)際上是致病決定基因功能的表現(xiàn)，今后的比較基因組學(xué)研究重點(diǎn)在于致病決定基因的比較和篩選。

5 布魯氏菌進(jìn)化基因組學(xué)

進(jìn)化基因組學(xué)是通過(guò)研究生物進(jìn)化過(guò)程中基因組的動(dòng)態(tài)變化和基因的變異，從而揭示生物類群的親緣關(guān)系和進(jìn)化規(guī)律[18]。通過(guò)進(jìn)化足跡特征及直系、旁系同源評(píng)估等預(yù)測(cè)布魯菌祖先屬于需氧、可自由生活、能運(yùn)動(dòng)的異養(yǎng)生物，棲息于根瘤菌植物中[19]?；诮壘甑谋容^分析推測(cè)，布魯氏菌及其祖先是一種能自由生活的生物有機(jī)體，之后逐漸進(jìn)化為動(dòng)物寄生菌。目前準(zhǔn)確的進(jìn)化進(jìn)程仍然是未知的，但研究顯示與布魯氏菌基因組中基因的缺失、獲得和修飾等有關(guān)[20]。基于全基因組序列的進(jìn)化分析顯示，綿羊附睪種是一種比較古老的布魯氏菌，而牛種和羊種布魯氏菌則是分化程度較高的種；通過(guò)比較種系發(fā)育推測(cè)牛種菌和羊種菌有共同祖先[21]。布魯氏菌基因組不僅缺乏種內(nèi)重組的依據(jù)，而且基因組中的部分差異區(qū)段具有外源DNA的特征,且在差異區(qū)段在不同菌株中的分布不同,表明這些差異區(qū)段是從外部獲得的；與基于看家基因的進(jìn)化樹(shù)相比,部分差異區(qū)段在不同種型間呈現(xiàn)規(guī)律性的分布，而另外一些并未隨進(jìn)化關(guān)聯(lián)而呈現(xiàn)獲得與缺失的規(guī)律性變化，表明基因的獲得與缺失可能與布氏菌的適應(yīng)性進(jìn)化相關(guān)[22-23]。布魯氏菌進(jìn)化基因組不僅對(duì)了解布魯氏菌的種內(nèi)、種間進(jìn)化，推測(cè)菌種起源有重要作用，而且對(duì)闡明布魯氏菌的微進(jìn)化及適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制具有重要意義。

6 結(jié) 語(yǔ)

當(dāng)前，布魯氏菌基因組學(xué)已成為學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)和研究的重點(diǎn)，隨著細(xì)菌基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展成熟，基于新一代高通量測(cè)序技術(shù)的全基因組測(cè)序，不僅可以預(yù)測(cè)布魯氏菌的重要基因、蛋白以了解其功能和可能機(jī)制；同時(shí)，在布魯氏菌的致病性和防治方面，可以鑒定致病相關(guān)基因、開(kāi)發(fā)和研究疫苗、開(kāi)發(fā)新型抗生素等；在布魯氏菌的遺傳進(jìn)化方面，可以研究種內(nèi)、種間進(jìn)化關(guān)系、了解進(jìn)化規(guī)律；還可成為研究布魯氏菌遺傳進(jìn)化機(jī)制和預(yù)測(cè)篩選關(guān)鍵基因的重要工具。因此，布魯氏菌基因組學(xué)研究必將在布病的防治研究工作中發(fā)揮重要作用。

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Progress in genomic research ofBrucella

LIU ZHi-guo1,2,3,WANG Miao3,CUI Bu-yun4,LIU Ri-hong3,XIA Xian-zhu5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot01008,China; 2.UlanqabBureauforHealth,Ulanqab012000,China; 3.UlanqabCenterforEndemicDiseaseControl,Ulanqab012000,China; 4.NationalInstituteofInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPreventionCollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDisease,Beijing102206,China; 5.InstituteofMilitaryVeterinaryAMMS,Changchun130062,China)

Brucellais a gram-negative, intracellular bacterium. Lacking of classical virulence factors, pathogenesis was not only relying on the invasiveness and endotoxin, but also depends on the strong ability to adapt to the environment. At present, the mechanisms of invasion of the body and in the intracellular of continued presence is not clear. TheBrucellagenomic research can not only fully explain the characteristics ofBrucellagene composition, molecular evolution, virulence factors and pathogenic mechanism, but also be used for some of the pathogenic genes and important protein prediction. And to offered candidate loci for further reasearch. Meanwhile, provided a molecular basis for the research and development of new vaccines and antibiotics, so as to supply a theoretical basis for the construction of new effective treatment and prevention strategies of brucellosis. This is an overview of genomic forBrucella, includeBrucellagenome composition and characteristics, analysis of the whole genome sequencing, comparative genomic, and evolutionary genomics research progress.

Brucella; genomic; comparative genomics; evolution genomics

s: Xia Xian-zhu, Email: xiaxzh@cae.cn; Cui Bu-yun, Email: cuibuyun@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.018

夏咸柱,Email:xiaxzh@cae.cn 崔步云,Email:cuibuyun@icdc.cn

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 10018; 2.烏蘭察布市衛(wèi)生局，烏蘭察布 012000; 3.烏蘭察布市地方病防治中心， 烏蘭察布 012000; 4.中國(guó)疾控中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206; 5.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122

R378.5

A

1002-2694(2015)12-1177-04

2015-03-12；

2015-06-11

內(nèi)蒙古衛(wèi)計(jì)委醫(yī)療衛(wèi)生科研項(xiàng)目(No.201301094)資助

Funded by the Medical and Hygiene Research Projects of Inner Mongolia Health and Family Planning Commission (No. 201301094)